1.4、0.5h第三课定点诱变在蛋白质工程中应用.ppt

第三节定点诱变在蛋白质工程中的应用 分生教研室 曲 萌 第三节定点诱变在蛋白质工程中的应用 提高蛋白质的稳定性: 延长酶的半寿期 提高酶的热稳定性； 延长药用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失 改造实例 1. 提高T4溶菌酶的热稳定性 2. 对酵母磷酸丙糖异构酶的改造 3.提高蛋白质热稳定性的其他方法 4.提高重组β干扰素的专一活性和稳定性 5 改进α1抗胰蛋白酶 改造实例 6.改变酶的动力学活性 7.改变酶的最适pH 8.提高酶的活性 9.改善酶的特异性 10.提高蛋白质的生物学活性 1. 提高T4溶菌酶的热稳定性 1.改造思路： 在没有二硫键的蛋白质分子中导人二硫键 2.改造措施： 第3位的异亮氨酸Ile 半胱氨酸Cys 第9位、164位、21位、142位突变成半胱氨酸 3.效果检测：如图 蛋白质工程的主要步骤通常包括： 1 分：从生物体中分离纯化目的蛋白； 2 测：测定其氨基酸序列；借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段 尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构; 3钓：设计引物或探针，从文库中获取编码该蛋白质的基因序列 4设：设计改造方案 设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与 去折叠等对其活性与功能的影响； 设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变； 5改：对基因序列改造 6表：通过基因工程表达 7检：分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。 二硫键 两个半胱氨酸通过脱氢后可以二硫键相结合，形成胱氨酸。 具有二硫键的蛋白质一般不易去折叠，热稳定性较 高，在有机溶剂或非正常生理条件(极端pH条件)下也不 易变性。 2. 对酵母磷酸丙糖异构酶的改造 1.突变依据： 脱氨 Asp/Glu 构象改变 失活 Asn/Gln 其他氨基酸 热稳定性提高 2.突变措施： Thr/Ile 热稳定性提高 14/78 Asn Asp 热稳定性降低 结论：对蛋白质中非必需的Asn突变, 可提高蛋白质热稳定性 3.提高蛋白质热稳定性的其他方法 1.对其他氨基酸进行替换： Gly Ala/导入Pro 2.增加折叠蛋白质中稳定相互作用的数目： 增加内部的疏水性氨基酸，可提其的稳定性 3.替换Asp、Cys、Met 4.氨基酸替换效果可定量，稳定性效果可以叠加 4.提高重组β干扰素的专一活性和稳定性 1.作用 2.合成情况： 活性非常低，是天然糖基化蛋白的10% 形成二聚体与寡聚体 3.设计与改造： Cyc17 Ser 4.突变结果: 活性提高，稳定性增强 5 改进α1抗胰蛋白酶 1.主要功能： 抑制中性白细胞弹性硬蛋白酶的活性 2.作用机制： 与中性自细胞弹性硬蛋白酶迅速结合后将 其Met358和Ser359之间切断。 3.给药途径：静脉注射 4.改造措施： Met358 Val358 抗氧化能力增强 中性白细胞弹性硬蛋白酶 可对肺造成损害，长期作用可能发展成肺气 肿，使肺不可逆地失去弹。 健康情况下： α1抗胰蛋白酶扩散至组织间隙，同 中性白细胞弹性硬蛋白酶形成复合 体，经循环系统，在肝桩和肾脏中 解毒排出。 α1抗胰蛋白酶缺损症： 关节组织还没成熟就会被分解。 6.改变酶的动力学活性 酶促反应过程： 酶（E）+底物(S) 酶-底物复合物（ES）