pNTAP-MK2真核表达载体构建和其稳定表达细胞系建立.PDF

窑2310窑 南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 2010;30(10) pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立 1袁2 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 王达 袁龚小卫 袁刘爱华 袁梅柱中 袁王 丹 袁明小燕 袁王 旭 袁魏 洁 袁邓 鹏 袁姜 勇 渊南方医科大学 病理 3 2 生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室袁 南方医院呼吸科袁 广东广州 510515曰 暨南大学医学院病理 生理学系袁广东 广州 510632冤 摘要院目的构建pNTAP-MK2 真核表达质粒袁并建立其稳定表达的HEK293 细胞系遥 方法将MK2 亚克隆至串联亲和 纯化载体pNTAP质粒上袁 构建成重组质粒pNTAP-MK2袁 转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5琢袁 阳性克隆进行 PCR尧酶切及DNA测序验证正确后袁利用脂质体PolyFect 介导将其转染至HEK293 细胞中袁再通过G418筛选建立稳 定表达TAPtag-MK2 融合蛋白的HEK293 细胞系曰 利用Westernblotting 和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-MK2 的表达及细胞内定位情况遥 结果重组真核表达载体构建正确袁该重组质粒能在HEK293 细胞中稳定表达袁表 达产物TAPtag-MK2 主要分布在核内遥 结论成功构建pNTAP-MK2 真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293 细胞系袁TAP标签未对MK2定位产生明显影响遥 关键词院MAPK激活蛋白激酶2曰pNTAP曰真核表达载体曰分子克隆曰基因表达 中图分类号院Q78 文献标志码院A 文章编号院1673-4254(2010)10-2310-04 ConstructionofpNTAP-MK2eukaryoticexpressionplasmidandestablishmentofacellline foritsstableexpression 1,2 1 3 1 1 1 1 1 1 WANGDa-an ,GONGXiao-wei,LIUAi-hua,MEIZhu-zhong,WANGDan,MINGXiao-yan ,WANGXu,WEIJie,DENGPeng, JIANGYong1 1 Department of Pathophysiologyand Key Laboratoryfor Proteomics of Guangdong Province , Department of RespiratoryDiseases, NanfangHospital3 2 ,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,Jinan University,Guangzhou510632,China Abstract: Objectives ToconstructpNTAP-MK2eukaryoticexpressionplasmidand establishaHEK293cellline stably expressingtandamaffinitypurification (TAP)-taggedMK2. Methods TheMK2-encodingregionwa