基因工程序课时1.ppt

* 一、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取。 2．______________的构建。 3．将目的基因导入_________。 4．目的基因的检测与鉴定。 基因表达载体 受体细胞 一、为什么要有“目的基因的获取”这一步？ 二、为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。 三、为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？ 四、为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？ 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。 2.基因文库的构建方法 ①鸟枪法： 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接 载入 受体细胞 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 (直接分离法) (一)从基因文库中获取目的基因 ②反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 目的基因的mRNA 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA 反转录酶 核酸酶H 2.基因文库的构建方法 DNA聚合酶 双链DNA (目的基因) ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2.基因文库的构建方法 (二)利用PCR技术扩增目的基因 1. 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____ 复制___________ 的核酸合成技术 2.原理：__________ 4.方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 5.结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 (二)利用PCR技术扩增目的基因 3.过程: (变性、退火、延伸) 条件： 四种脱氧核苷酸 一对引物 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） DNA的两条链为模板 温度控制 PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 点点生物学教学 寻根问底—— （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 1. 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 基因表达载体的组成： 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 编码区上游 编码区下游 RNA聚合 酶结合位点 RNA聚合 酶结合位点 编码 蛋白质 调控 调控 原核细胞 真核细胞 真核细胞 1.启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录. 2.终