质粒DNA限制性酶切图谱分析报告.pptVIP

五、注意事项——DNA凝胶电泳 六、限制性内切酶酶切常见问题分析 六、限制性内切酶酶切常见问题分析 六、限制性内切酶酶切常见问题分析 五、限制性内切酶酶切常见问题分析 五、限制性内切酶酶切常见问题分析 五、限制性内切酶酶切常见问题分析 七、DNA电泳常见问题分析 七、DNA电泳常见问题分析 七、DNA电泳常见问题分析 七、DNA电泳常见问题分析 七、DNA电泳常见问题分析 DNA降解 电泳缓冲液陈旧 所用电泳条件不合适 DNA上样量过多 DNA样含盐过高 有蛋白污染 DNA变性 避免核酸酶污染 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 减少凝胶中DNA上样量 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 电泳前酚抽提去除蛋白 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA 问题一：DNA带模糊 原因 对 策 对于λ/Hind III片段cos位点复性 电泳条件不合适 DNA变性 电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟 电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 问题二：不规则DNA带迁移 对 策 原因 DNA的上样量不够 DNA降解 DNA走出凝胶 对于EB染色的DNA，所用光源不合适 增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低 避免DNA的核酸酶污染 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 应用短波长（254nm）的紫外光源 问题三：带弱或无DNA带 对 策 原因 小DNA带走出凝胶 分子大小相近的DNA带不易分辨 DNA 变性 DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 在脉冲凝胶电泳上分析 问题四：DNA带缺失 对 策 原因 * * 一、DNA的限制性酶切实验原理 实验三 质粒DNA限制性酶切图谱分析 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 1. 限制性内切酶的类型 一、DNA的限制性酶切实验原理 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。 1. 限制性内切酶的类型 一、DNA的限制性酶切实验原理 第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 1. 限制性内切酶的类型 一、DNA的限制性酶切实验原理 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’