血清生化物质测定步骤探讨.doc

血糖测定方法（邻甲苯胺法） 一、原理：葡萄糖为一含醛基的己糖，在酸性与加热情况下脱水反应生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合成芳香族第一级胺青色的席弗氏碱。 二、试剂： 1、邻甲苯胺试剂：取冰醋酸920ml，加入硫脲（Thiourea）1.5g，待其溶解，加邻甲苯胺（o-Toluidine）80ml，充分混合后，取此液960ml加入饱和硼酸溶液40ml，混匀，放置于棕色瓶中。 2、饱和硼酸溶液：称取硼酸6g，以蒸馏水溶解并稀释至100ml，放置一夜，过滤即可应用。 3、葡萄糖贮存标准液（1ml=5mg）：将少量无水葡萄糖，CP置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖500mg，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液加至刻度。此液可长期保存。 4、葡萄糖应用标准液（1ml=0.05mg）：取葡萄糖贮存标准液1ml置于100ml容量瓶内，加入饱和苯甲酸溶液至刻度。 5、饱和苯甲酸溶液：称取苯甲酸（Benzoicacid）2.5g，于800ml蒸馏水中，加热溶解，冷却后加蒸馏水至1000ml。 三、操作： 步骤 管别 测定管 标准管 空白管 血清（ml） 0.1 葡萄糖应用标准液（ml） 0.1 蒸馏水（ml） 0.1 邻甲苯胺试剂（ml） 5.0 5.0 5.0 放沸水煮沸8min，冷水冷却，用640nm或红色滤光板光电比色，用蒸馏水作空白，记录各读数。 计算：（测定-空白）/（标准-空白）*0.1*100/0.1=葡萄糖毫克% 血清白蛋白测定（酚试剂法） 原理：用硫酸钠将血清中球蛋白沉淀，所分离的白蛋白加酚试剂而呈蓝色，与含酪氨酸的标准管比色，求得白蛋白量。血清总蛋白减去白蛋白即为球蛋白量。 白蛋白与球蛋白分离：球蛋白与白蛋白不同，具有易溶于稀盐溶液而不溶于浓盐溶液的特点。故以23%硫酸钠或21%亚硫酸钠溶液沉淀球蛋白。再利用乙醚将白蛋白与球蛋白分离。 试剂： 酪氨酸标准液（1ml=0.2mg）：精确称取酪氨酸（Tyrosine）0.2g，置于1000ml容量瓶中，用0.1当量盐酸溶液稀释至刻度。 2、0.1当量盐酸溶液：取浓度为36.5%，浓度为11.9M的市售浓HCl加水配制成1L: 取XL的上述浓盐酸,因为盐酸是1-1价的离子组成的酸,当量浓度等于MOL浓度,据配制前后溶质的MOL数相等,则有如下计算: (X*11.9)/0.1=1,X=0.0084L.将浓盐酸加入到1000ML的容量瓶中,再加水到1L刻度为止即得 23%硫酸钠溶液：称取无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1000ml。加热溶解，冷却后补足蒸馏水量。 酚试剂：钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g 钼酸钠（NaMO4·2H2O）25g 蒸馏水 700ml 置于2000ml烧瓶内，再加入85%磷酸（H3PO4）50ml，浓盐酸（HCl）100ml。 应用回流冷凝器煮沸10小时（烧瓶内可加入小玻璃珠10数颗，以防煮沸时溶液冲入冷凝管而溢出）。除去冷凝管后，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml，溴液（或30%过氧化氢）数滴，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴（或过氧化氢）。因溴刺激性大，应在排气柜内进行。制成的酚试剂为鲜明黄色，保存于棕色瓶内备用。 5、10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠100g，加100ml蒸馏水至100 三、操作： 步骤如下：（1）取边缘完整的试管一支，加入血清0.2ml； （2）加入23%硫酸钠溶液3.8ml，混匀； （3）吸取1ml于另一试管内，作为总蛋白管； （4）在原管内加入乙醚不少于2ml，堵住管口用力振荡10余次； （5）放置在37℃水温箱内，不少于10min，2500转离心沉淀5min， （6）斜执试管，使中层的球蛋白能与管壁分离，用1ml吸管沿管壁通过球蛋白的空隙处插入管底，小心吸取清晰的白蛋白液至1ml；（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。 （7）拭去吸管外壁的液体和球蛋白，然后移于另一试管内，作为白蛋白管。 （8）取试管3支，按表操作 步骤 管别 总蛋白 白蛋白管 标准管 空白管 总蛋白悬液（ml） 1 白蛋白悬液（ml） 1 酪氨酸标准液（ml） 1 23%硫酸钠溶液（ml） 1 10%氢氧化钠溶液（ml） 4 4 4 4 酚试剂（ml） 1 1 1 1 蒸馏水（ml） 2 2 2 2 混匀后，静置10min，用520nm或绿色滤光板光电比色，以蒸馏水校正光密度到0点，记录读数。 计算： 总蛋白：（测定-空白）/（标准-空白）*0.2*100/0.05*16/1000=白蛋白克% 白蛋白：（测定-空白）/（标准-空白）*0.2*100/0.05*16.6/1000=白蛋白克%