病理解剖技术浅谈.ppt

* * * * K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法 （实验结果介绍） 免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包埋所采用的是环氧树脂618或812，都需高温聚合，这样可使多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了Lowicryls K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机（SPI#17020），对免疫电镜观察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题进行一下总结。 一、紫外线低温包埋机（SPI#17020） SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，温度可以控制在-10℃～-37℃之间。通过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达36小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入72个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为360nm的紫外灯，低温和室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。 总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。 二、Lowicryls K4M 低温包埋剂 Lowicryls K4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关，而且Lowicryls K4M具有亲水性，因此它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。 三、方法 1.包埋剂的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋剂由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：　　 （1）Lowicryls K4M：单体 17.30g；交联剂2.70g；引发剂0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅3～5分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。 （2）Lowicryls K4M的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。 2.组织和细胞的取材、固定、处理 （1）组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成1～3mm3的小块, 迅速置于3%多聚甲醛- 1%戊二醛固定液中, 2～3h。 （2）细胞的取材与固定：将含有细胞的培养液转移到离心管中，离心15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上3%多聚甲醛～1%戊二醛固定液固定2～3h。 （3）组织或细胞处理过程 将固定好的标本用0.01mol/L 磷酸缓冲液冲洗, 10min×3次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封闭游离的醛基30min； 0.01mol/L 磷酸缓冲液1h；4℃ 30%,50%乙醇脱水30min； -20℃乙醇系列逐级脱水至100%，各1h（乙醇溶液应先在冰箱中预冷）。-20℃低温包埋剂逐级渗透 , 纯包埋剂浸透过夜。标本放入含包埋剂的胶囊加盖后放入紫外线低温包埋机中，-20℃下用紫外线灯照射24h；室温紫外线灯继续照射3～4天，使样品完全聚合固化。超薄切片厚度50～70nm，展片后捞在覆有福尔马膜的镊网上。 3.免疫染色 免疫标记的切片用3%的H2O2 室温下处理6～10min后，用0.01mmol/L PBS缓冲液冲洗10min×3次。然后在1%BSA-PBS封闭也上封闭30min，甩去不洗，滴加稀释好的一抗（如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在25℃左右20～60min；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在30℃左右下20～60min）。再次用0.01mmol/L PBS缓冲液漂洗和1%BSA-PBS封闭后用5nm胶体金IgG探针标记60min，最后经缓冲液冲洗，每次10min。阴性对照样品在标记前省却一抗孵育步骤。标记后的切片经醋酸铀和柠檬酸铅各染色10min ,用JEM-122O透射电镜下观察。 利用羊抗兔IgG胶体金探针对大鼠肺组织进行免疫金标记，结果显示在大鼠的肺泡壁内毛细血管内皮细胞胞浆中可见散在分布的金颗粒。对细胞进行免疫标记，待检测的物质位于细胞内时，最好采用10nm胶体金进行精细定位。如果待检测物质位于细胞壁，则采用15～20nm胶体金。 四、结果 五、讨论 免疫电镜技术面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，本