RNA病毒检测简述.ppt

第一章 RNA的提取和cDNA的合成 RT-PCR原理 提取总RNA 以其中的mRNA作为模板 反转录 cDNA PCR 作模板 获得目的基因 一、RNA的提取 RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。 采取的措施： 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘烤2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 注意事项： 1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 总RNA提取方法（试剂盒）： 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 （2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。 （3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥发，痕量的乙醇很容易挥发掉。 Yeast Total RNA 二、cDNA的合成 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。 2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。 cDNA引物 种类： 1、随机引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 第二章 聚合酶链式反应（PCR） * PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 PCR的原理：体外DNA复制 包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。 一、PCR基本步骤 三个步骤： 1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。 2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度(72℃左右)下，以目的DNA为