第四讲之十讲生物制药.doc

第四章　　细胞培养技术制药 第一节 动物细胞制药 一、动物细胞制药的基本原理 ·动物细胞制药首先涉及到的就是细胞体外培养的一些基本原理和基本操作，这些和普通的细胞体外培养技术基本一致 ·表达过程中能以正确的方式进行折叠和修饰 ·大多数能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了生产的蛋白质具有天然产物抑制的活性、免疫原性和体内寿命 ·一些人用和兽用的重要药物蛋白，尤其是相对较大、复杂或糖基化的蛋白质来讲，动物细胞培养制药是首选的生产方式，如病毒疫苗、干扰素等 1. 用于蛋白药物生产的细胞系 CHO（中华仓鼠卵细胞），MRC-5人淋巴母细胞，重组NS0，BHK，鼠杂交瘤细胞，SP2/0，FRh1－2，BIRMA-1细胞系，LB－2细胞，ES-15ES－4细胞系，MS20 2. 细胞的凋亡 ·在 10 升以上的发酵罐中培养密度超过每毫升百万个细胞—技术还不成熟 ·为了获得最大的产量，人们把注意力一直放在生物反应器的设计和培养基的优化设计上 ·最近，细胞凋亡在限制培养性能方面的影响才开始列入考虑范围 ·一般地讲，经受程序死亡的细胞都接受到了一个死亡刺激信号 ·信号转变成对细胞的程序性破坏 1）细胞凋亡引发的途径 ·至少有两条途径引发细胞凋亡·受体介导途径—胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase ·线粒体介导途径 —释放凋亡酶激活因子激活caspase 2）细胞凋亡的诱因 细胞培养中，除了程序性凋亡外，细胞凋亡还和培养的环境有关 外界因素 ·营养成分的耗竭，会引起细胞的衰老和凋亡 ·培养中产生的活性氧，可能导致细胞凋亡 ·培养液中的渗透压提高与细胞凋亡的增加呈正相关，但是增加二氧化碳的分压，并不增加细胞的凋亡 ·丁酸能够促进哺乳动物某些启动子（如CMV和SV40）控制的基因表达，但是它也能抑制细胞生长，诱导细胞凋亡 ·剪切力是生物反应器环境中另一个导致细胞死亡的潜在原因，高强度的剪切力会导致坏死性细胞死亡，但较低强度剪切力的影响还不清楚 ·由于代谢压力而引起的细胞内环境的改变也会诱导细胞调亡，如在低pH的环境下，半胱氨酸蛋白酶（caspases）的激活过程更快 ·细胞间信号传递在源于培养的细胞凋亡中起重要作用，如细胞会释放自分泌因子，以响应密度、营养水品或受体介导的毒性代谢物的存在，一些能降低细胞间联系的生长因子抑制剂，如阿拉明可阻止细胞凋亡 3. 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 1）表达用载体 ：启动子，增强子，选择标记，mRNA剪切位点和多聚核苷酸序列，多克隆位点和复制必需成分 2）DNA导入动物细胞常用的技术 ：外源DNA导入到哺乳动物细胞的过程称转染 ，脂质体转染技术，电穿孔技术，基因枪，DEAE-葡聚糖方法，磷酸钙沉淀法 3）DNA在细胞内的表达 ·瞬时表达是指外源DNA导入细胞内后，不经过选择培养，外源DNA在细胞增殖过程中逐渐丢失，目的蛋白的表达也是短暂的。该培养方法简捷，周期短 ·永久表达是指外源DNA导入细胞内后，经过选择培养，外源DNA稳定地存在于细胞中，目的蛋白的表达持久恒定 二、转基因动物细胞生产的药物 ·干扰素β－1a，治疗回归热性硬结病人临床恶化，CHO细胞生产，2002年上市 ·重组糖蛋白，Tenecteplase，可减低急性心肌梗塞死亡率，CHO，2000年上市 ·重组糖蛋白，抗血友病因子，CHO，2000年上市 ·内源糖蛋白，干扰素α－n1，治疗慢性丙肝，人淋巴母细胞，1999年上市 ·重组血友病VIIa因子，治疗A型和B型血友病，BHK,1999年上市 ·IgG1和TNF受体融合，治疗风湿性关节炎，CHO，1999年上市 ·重组血凝因子IX，控制B型血友病病人的出血，CHO，1997年上市 第二节 转基因动物制药 首个转基因动物生产药物－ Atryn ·2009年2月6日首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn上市 ·山羊奶中产生抗凝血酶，用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症 ·马萨诸塞州的GTC生物制药公司研发生产 一、产生重组蛋白的动物组织系统 ：血液，尿液，精液，蛋清，蚕茧，乳汁 二、转基因动物操作的原理和方法 1. 重组载体的构建 ：·编码区·启动子·增强子·调控元件·筛选标记 2. 转基因技术 ：·直接核DNA显微注射·逆转录病毒载体感染胚胎·囊胚内注射遗传改变的胚胎干细胞 ·精子作为基因转移的载体 3. 胚胎分割和核移植技术 ·胚胎分割就是在动物胚胎早期，每个细胞有全能性的时候，将各个细胞分离开，重新发育成胚胎，而且可以将胚胎能冻保藏，可以将有优良性能的胚胎保持下去 ·核移植就是将胚胎的细胞核或体细胞的细胞核，移植到去核的受精卵或卵细胞中，以获得优良遗传性能的动物 第三节 植物细胞制药 一、研究概况 ·植物细胞培养现在已经