牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法（编制说明）.doc

PAGE PAGE 2 标准编制说明 标准名称：牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法 标准起草单位：广西壮族自治区兽医研究所 一、项目的来源和目的 隐孢子虫病是一种由隐孢子虫引起的、呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。隐孢子虫主要引起幼龄动物的消化道和呼吸道疾病，导致其生产性能下降或死亡。对人而言，隐孢子虫主要引起儿童和免疫抑制病人的腹泻，在艾滋病(AIDS)病人和儿童中感染率分别高达48.0%和17.5%，是艾滋病病人的重要致死因素之一。该病已被列为世界最常见的腹泻疾病之一。牛隐孢子虫主要通过饲料、饮水等经口传播给动物，通过牛乳、饮水、蔬菜等食物经口传播给人，常引起暴发性流行。国内流行病学调查发现，我国奶牛隐孢子虫病的病原体多为微小隐孢子虫（C. parvum）和安氏隐孢子虫（C. andersoni），部分为混合感染。微小隐孢子虫（经常感染新生犊牛、婴儿和其他幼龄动物的肠道，导致腹泻和脱水等症状。安氏隐孢子虫感染奶牛后可以引起奶牛产奶量下降，体质量减轻，是影响奶牛业发展的重要致病因素之一，亦有少数人体感染病例。广西作为养牛大省，运用分子生物学手段对在隐孢子虫进行检测方面的研究报道基本是空白，本规程旨在建立一种能同时快速检测牛隐孢子虫的多重PCR方法，在推广先进的隐孢子虫病原检测技术，保障我区绿色养牛产业发展和食品安全等方面具有重要意义。本标准仅涉及与牛相关的隐孢子虫。 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近年发展起来的一种分子生物学诊断技术，能在数小时内快速检测出痕量的病原核酸。它具有传统病原分离鉴定和血清学方法所无法比拟的特异、敏感和快速等优势。在发达国家，PCR已作为有效的病原检测手段得到了广泛应用。世界动物卫生组织（OIE）也将PCR方法列为多种动物病原最为可靠的检测方法之一。多重PCR技术一次反应可以检测多个基因，比单一PCR技术更为方便、快捷、经济，减轻了工作量。 隐孢子虫形体小, 对恶劣环境有较强的抵抗力, 无特异性染色, 光学显微镜下缺乏明显特征, 少量卵囊足以使人感染, 因此建立特异性强、敏感性高、快速、简捷的多重PCR检测方法是当前隐孢子虫病防治和流行病学调查工作迫切需要解决的问题之一。 为此，广西壮族自治区质量技术监督局下达文件《关于下达2011年第十二批广西地方标准制定（制订）项目计划通知》（桂质监函[2011]884号）附件的编写任务通知，将《牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法》广西地方标准的编制任务落实到广西壮族自治区兽医研究所，接到任务后，广西壮族自治区兽医研究所结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以杨威为组长，李军、彭昊、陶立、陈泽祥、马春霞、许力干、胡帅、谢宇舟、禤雄标、谢永平、潘艳等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。本操作程序是在充分参考文献资料及实验和生产应用验证的基础上，制订出适合于临床快速诊断牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的检测标准。 二、工作概况 （一）在检测方法研制方面的工作情况 广西壮族自治区兽医研究所自2008年开展国家公益性行业（农业）专项“边境地区动物疫病预防控制技术体系研究”项目研究以来，在牛隐孢子虫相关研究上取得了以下研究成果： ① 在广西进行牛隐孢子虫流行病学调查，掌握了牛隐孢子虫感染种类、感染率、宿主易感年龄、感染季节等流行病学资料。 ② 隐孢子虫DNA模板的快速提取：将传统的隐孢子虫DNA提取方法如冻融法、超声粉碎法、液氮研磨法等与利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取方法做比较，发现粪便基因组DNA提取试剂盒方法简便快速，易于操作。 ③ 安氏隐孢子虫的快速检测：基于ITS-1基因建立的安氏隐孢子虫快速PCR检测方法，最低检出卵囊量与经典的巢式PCR方法相差无几，敏感性相似，只需一次扩增即可获得检测结果，在临床检测安氏隐孢子虫上具有更好的应用性。 ④ 微小隐孢子虫的快速检测：根据国外的研究结果，合成一对引物，扩增牛微小隐孢子虫卵囊壁蛋白基因(COWP)，在临床上应用，取得了良好的效果。 ⑤ 牛隐孢子虫多重PCR方法的建立：根据牛微小隐孢子虫COWP基因和安氏隐孢子虫ITS-1基因，设计合成两对特异性引物，进行牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的临床检测。PCR扩增长度分别为1033 bp和263 bp，通过反应条件的优化以及特异性试验、敏感性试验、重复性试验及扩增片段序列测定的验证，证实该方法可以快速便捷检测牛隐孢子虫，并区分其种类，可用于牛隐孢子虫的流行病学调查及临床诊断。 （二）在标准起草方面的工作情况 为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成二个小组，其中一个小组负责做生产实践的调查研究，深入到广西南宁、柳州、贵港、来宾、玉林、北海等地一些