柠檬酸发酵机理.ppt

柠檬酸发酵的环境条件： ★磷酸盐浓度低 ★ NH4+做N源 ★ pH＜2.0 ★溶氧高 ★ MN2+、Fe2+、Zn2+含量极低 顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶→ pH2.0时，失活 →阻断TCA循环→积累柠檬酸。 顺乌头酸水合酶需要Fe2+， 在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸。 第三节 柠檬酸发酵机理 重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节机制。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。 1940年，Krebs: TCA； 1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。 1958年，McDonough发现，在形成柠檬酸的条件下，HMP途径的酶也存在于黑曲霉中。 一、柠檬酸合成途径的发现 EMP途径三个关键酶： 1.葡萄糖激酶 2.果糖-6-磷酸激酶 3.丙酮酸激酶 HMP途径 TCA循环 CO2固定反应 1.PEP羧激酶 2.丙酮酸羧化酶 二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。 (1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。 (3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。 三、乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸 3醋酸 ? 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸 = 90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。 解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。 异柠檬酸裂解酶切割异柠檬酸产生乙醛酸和琥珀酸 乙醛酸经苹果酸合成酶催化，在水的存在下接受乙酰辅酶A的乙酸，生成苹果酸。 四、柠檬酸生物合成的代谢调节机制 1、磷酸果糖激酶（PFK）： 受柠檬酸、ATP抑制其 受AMP、无机磷、NH4+激活 （一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节 Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响 Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。 Mn2+ 缺乏菌体TCA酶活力下降！ 2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。 3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应 不被乙酰CoA抑制，ａ-酮戊二酸仅由微弱抑制，所以调节性很差，几乎不受代谢产物的调节。 （二）三羧酸循环的调节 1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。