（毕业设计论文）《果胶酶产生菌的筛选及其条件优化》.docVIP

PAGE 实验序号 实验7 实验名称 特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一） 实验时间 2011.11.15--12.15 实验室 118 一、实验目的： 1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法； 2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物； 3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法； 4、了解酶学性质的研究。 二、 实验原理 1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性 HYPERLINK /view/84137.htm \t _blank 多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约5万——30万，主要存在于植物的 HYPERLINK /view/3687.htm \t _blank 细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。果胶质是一类高分子碳水化合物，普遍存在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。 2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要来自于霉菌。果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类脱胶和饲料方面。 3、果胶酶的酶活测定方法： ①、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。 ②、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。 ③、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。 ④、还原糖法（DNS法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 4、影响微生物发酵的因素有很多； ①、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、碳源的浓度、氮源的浓度、无机盐、水含量等； ②、菌种接种的量； ③、发酵条件：温度、PH、溶解氧等； ④、附加条件：诱导物、表面活性剂等 （5）、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂、抑制剂。 （6）、果胶酶的最适催化PH为酸性，在3.5左右，而DNS的显色PH为碱性。 三、实验设备及材料： 1、实验设备：天平、灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、恒温水浴锅、计时器（精确到秒）、分光光度计、离心机、烘箱、PH计数器。 2、实验用具：烧杯、三角瓶、试管、移液枪（枪头）、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵、试管架、玻璃棒、纱布、绳子、离心管、比色皿、培养皿。 3、实验试剂： ①、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652克，柠檬酸钠7.5克，溶解定容至1000ml，用0.1M NaOH或0.1M HCl调节PH至3.0。 ②、底物——0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用PH=3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，在电磁炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4 ℃，7天内有效。 ③、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500mL水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入2，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后过滤使用。 4、实验材料：从周围环境采集的土样或腐烂的水果上的霉菌。 5、培养基： ①、基本培养基； 成分及条件 果胶 磷酸二氢钠 蛋白胨 琼脂 pH 含量及水平 1% 0.5% 1% 2.0% 4.5 ②、分离培养基； 成分及条件 果胶 磷酸二氢钠 琼脂 pH 含量及水平 0.5% 0.5% 2.0% 4.5 ③、发酵培养基； 成分及条件 果胶 磷酸二氢钠 蛋白胨 pH 含量及水平 1% 0.5% 1% 4.5 ④、种子培养基； 成分及条件 麸皮 橘子粉 硫酸铵 葡萄糖 磷酸二氢钾 pH 含量及水平 3.0% 2.0% 0.5% 1% 0.1% 4.5 ⑤、固体发酵培养基； 成分及条件 麸皮 橘子粉 硫酸铵 葡萄糖 水 含量及水平 10g 2.5g 0.1g 0.125g 15mL 四、实验步骤 （一）、半乳糖醛酸标准曲线的绘制； 1、先配制一系列浓度不同的标准曲线溶液，用选定的显色剂进行显色。 （1）、精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲液定