牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法（征求意见稿）.doc

ICS11.220 B41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2012 牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法 Detection of Dairy Cryptosporidium—Multi-PCR method （本稿完成日期：2012年02月23日） 2012- XX - XX发布 2012- XX - XX实施 广西壮族自治区质量技术监督局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　术语和定义 1 3　试验材料 1 3.1　特异性引物 2 3.2　试剂 2 3.3　仪器设备及耗材 2 4　操作程序 3 4.1　待检样品处理 3 4.2　待检样品　　 3 4.3　检测 3 4.4　阳性及阴性对照 3 4.5　电泳 ４ 5　结果判定 ４ 附录A（规范性附录）　 ５ 附录B（规范性附录）　 ６ 附录C（规范性附录）　 ７ 前言 本标准。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧局提出。 本标准起草单位：。 本标准主要起草人： 本标准为首次发布。 牛隐孢子虫的检测—多重聚合酶链反应法 范围 本标准规定了应用多重聚合酶链式反应（Multi-PCR）检测牛粪中的微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的技术要求 本标准适用于检测牛粪中的微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫。 术语定义下列术语和定义适用于本。安氏隐孢子虫是牛隐孢子虫病的重要病原体之一，感染奶牛后可以引起奶牛产奶量下降，体重减轻，饲料报酬减少，是影响奶牛业发展的重要致病因素之一，亦有少数人体感染病例。 聚合酶链反应polymerase chain reaction , PCR 又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，简称PCR技术。是模板DNA在引物和4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在的条件下，依赖于Taq DNA聚合酶的酶促反应。其特异性取决于引物与模板结合，反应分为三步，第一步变性：双链模板DNA加热变性，双螺旋氢键断裂解离后形成单链DNA；第二步退火：当温度突然降低至一定温度时，引物与模板DNA特异性结合；第三步延伸：在一定温度和有4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在的条件下，Taq DNA聚合酶催化引物介导的5′→3′方向的DNA合成。以上变性-退火-延伸过程为一个PCR循环，每次PCR循环的产物经下一次循环变性，亦作为引物引导DNA合成的新模板，如此经过若干循环后，介于两个引物之间的特异性DNA片段产量呈指数上升。 多重聚合酶链反应 multiplex polymerase chain reaction,Multi-PCR 简称Multi-PCR，是PCR技术的一种特殊形式。Multi-PCR技术是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，而多重PCR能够在同一反应体系内同时扩增多个靶序列，可用于多种病原体的快速鉴定。 引物primer 与待扩增 DNA 片段两互补的一段寡核苷酸。 特异性引物specific primer 针对特定模板 DNA 片段设计的一段互补寡核苷酸，在 PCR 反应中与模板 DNA 特异性结合。特异性引物引物使用浓度为L。引物序列附录 A。使用前先用灭菌双蒸水稀释。引物稀释分装成小量置于 -20 ℃ 保存备用试剂PCR 试剂２×Taq［ＵTaq／μ、μmol／、／（）、／、／电泳试剂10 mg/mL溴化乙锭倍Tris-硼酸电泳缓冲液其试剂灭菌双蒸水附录。仪器设备及耗材仪器设备PCR仪电泳仪紫外仪凝胶成系统小型高速离心机水浴锅-20℃冰箱 旋涡振荡器微量加样器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、μL～0 μL、0.5 μL～10 μL 等多种规格一次性耗材离心管：mL、1.5mL； PCR反应管：0.2 mL吸头：μL、200 μL、10 μL等多种规格操作程序取～，置充分，180～220 mg至2 mL离心管中供提或-20℃保存备用。180毫克（mg）～220 mg至2 毫升（mL）离心管中，μL DNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中进行后续反应或置-20℃保存备用。 多重 PCR 检测在冰浴条件下按下列试剂用量在 PCR 反应管中总体积为μL，分别加入２×TaqμL；灭菌双蒸水μL；微小隐孢子虫上、下游引物μL；安氏隐孢子虫上、下游引物μL；待检样品DNA：3 μL。加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，按如下程序进行 PCR 反应：95 ℃ 4 min；然后进入 95 ℃ 40 s ，61℃ 40 s ,72 ℃ 50 s 的循环，共进行 30 个循环；72 ℃ 10 min ；4 ℃ 结束扩增。PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置 -20