氧化低密度脂蛋白对THP1细胞凋亡影响及其机制研究.docVIP

氧化低密度脂蛋白对THP1细胞凋亡影响及其机制研究 　　摘要：目的 探讨氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对培养的人单核巨噬细胞（THP-1）凋亡的影响,并进一步探讨其凋亡产生的机制。方法 体外培养的人THP-1单核细胞经PMA诱导48 h，使形成巨噬细胞，将分化良好的巨噬细胞分别用不同浓度ox-LDL（0～100 μg/mL）培养48 h 和用75 μg/mL ox-LDL培养THP-1细胞不同时间（0～72 h）。应用Annexin-V和碘化丙锭双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡,用Western-bolt法检测GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达。结果 ox-LDL处理后的细胞凋亡率增加,并且呈时间和剂量依赖性,随着作用时间的延长和浓度的增加,凋亡呈递增变化，同时检测到 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达都增加。结论 ox-LDL可诱导THP-1细胞凋亡,其凋亡机制有内质网应激途径的参与。 　　关键词：氧化低密度脂蛋白；THP-1细胞；细胞凋亡；内质网应激 　　中图分类号：R329.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）08-0973-03 　　 　　近年来,细胞凋亡在动脉粥样硬化的形成和进展中的作用日渐成为研究热点,斑块破裂伴血栓形成是造成动脉粥样硬化临床急性症状的主要原因,而大量的细胞凋亡直接造成斑块不稳定［1］。巨噬细胞通过对斑块内脂质含量、炎症反应、纤维成分的降解及新血管形成等方面来影响动脉粥样硬化病变的进展,在动脉粥样硬化形成的所有阶段都起着极其重要的作用［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是动脉粥样硬化重要的危险因素,ox-LDL被巨噬细胞大量吞噬后会导致巨噬细胞胞浆内大量胆固醇的聚集并进一步形成泡沫细胞，同时会导致血循环中的单核细胞向内皮表面黏附并不断向内皮下趋化,并在内皮下分化成常驻的巨噬细胞［3］。内质网是细胞内重要的细胞器，内质网功能的损伤引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），通过激活未折叠蛋白质反应（UPR）以保护由ERS所引起的细胞损伤，长期过强的内质网应激便会诱导内质网相关性细胞凋亡［4］。不同于经典的凋亡途径，内质网应激反应性凋亡途径是一种最近提出的新的凋亡途径，研究其发生机制可为动脉粥样硬化等相关疾病的预防和治疗提供新的方向。本研究主要探讨ox-LDL对人单核巨噬细胞（THP-1）凋亡的影响及其引起凋亡的内质网应激机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 实验仪器 CO2孵箱（HERA cell 150）,倒置显微镜（Nikon TS100，日本）,超净工作台（LONGHONG，中国）,恒温水浴箱（HS-4，成都仪器厂）,低温台式离心机（Labofuge 400R，Heraeus），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。 　　1.1.2 实验试剂 人 THP-1单核细胞购自中科院上海细胞库。ox-LDL由北京医科大附属医院实验室馈赠。RPMI1640培养基（GIBCO公司，美国）,10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,胰蛋白酶（solarbio,Spain），PMA（Sigma,美国），鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均购自Santa Cruz美国公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 细胞培养与诱导 将人THP-1单核细胞悬浮于含10%胎牛血清的1640培养液中，在5% CO2、37℃、饱和湿度培养箱中静置培养。在光学显微镜下可见细胞呈球形，悬浮状态。视细胞生长情况进行传代、换液，选择生长良好的第3代～第5代细胞用于实验。实验前在培养液中加入终浓度为100 mmol/L的PMA孵育48 h，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。在光学显微镜下可见细胞转化为贴壁状态，并伸出伪足，呈现巨噬细胞形态。 　　1.2.2 实验分组 对照组:细胞置1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。ox-LDL组:在细胞培养瓶中分别加入ox-LDL（25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL）在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养48 h。在细胞的培养瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养24 h、48 h、72 h。 　　1.2.3 细胞凋亡的检测 采用Annexin V-FITC/PI双标记染色法进行检测，分组分孔收集细胞（1×106个），1 000 r/min离心5 min，弃上清液，每管用200 μL PBS重悬成单细胞悬液。加入10L Annexin