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基因克隆相关技术 二实验项目 实验16：质粒DNA的小量制备 实验17：质粒DNA的酶切与电泳鉴定 一实验目的 了解质粒DNA的特性; 掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法; 掌握多聚酶链式反应(PCR)的原理及方法。 (一)质粒DNA的小量制备 质粒结构的三大要素 碱裂解法小提质粒原理 碱裂解法小提质粒实验仪器、材料与试剂 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 试剂 LB液体培养基 质粒:PET28a(5Kb) SolutionⅠ SolutionⅡ(现用现配制) SolutionIII RNase A 无水乙醇 ，70%乙醇。 实验步骤 1、挑取带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时； 2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，离心收集菌体，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3、加入100?L预冷的溶液I ，振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，减少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解。 4、加入200?L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构 5、加入150?l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置3～5min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 6、12000 g离心10min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置10min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后室温干燥质粒10min ； 9、加入20?L含20 ?g/mLRNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于－20℃或直接用于酶切。 实验结果及讨论 碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。 注意事项 为提高质粒产量，要注意下面步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 (二)质粒DNA的酶切与电泳 Restriction endonuclease: cut each strand at specific site pUC18/19酶切位点的分布示意图 提取质粒的酶切实验步骤 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 轻轻混匀, 8000rpm离心10秒 ，置于37℃水浴中酶解1.5h。 酶解完成后，加入2?l 10×上样缓冲液, 混匀.即可加样进行琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖溶化再凝固后能形成具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 ； 而生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身大小和构象。 直接用低浓度EB进行染色，可确定DNA在胶中位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： 分子大小、 DNA构象、碱基组成； 琼脂糖浓度、电场强度、嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合,呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中,电泳缓冲液或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 常用的电泳缓冲液 仪器 电泳仪 水平电泳槽 恒温水浴箱 紫外灯 试剂 标准分子量片段；