福建医科大学 博士分子生物学 第四章PCR技术.ppt

增敏PCR是分两期进行的，第一期是在引物与模板均少的状态下进行，引物浓度仅为数十皮摩尔/升，延长退火时间，进行15-20个循环。这一期扩增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期扩增时加入过多引物间的相互反应，阻止引物二聚体的形成。 . 第二期中补加引物至0.1μmol/L，再于常规条件下进行20个循环。由此可见，增效PCR的第一期是为增加特异性，第二期是为增加特异靶序列产量而设计的。用此法检测E coli BMI l95耐红霉素基因（ere A），可检出粪便标本中1-10个细菌。 . 八、重 组 PCR 使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。基因表达调控是分子生物学研究的重要内容之一，需构建基因缺失、插入、点突变等一系列突变体以研究基因结构和表达的关系。有时还需将两个不同的基因融合在一起产生重组体，用重组PCR构建突变体及重组体是一个非常便利有效的途径。 . （一） 重组体的构建 传统的重组体的构建方法是将两个待重组的基因经过适当限制性内切酶消化再重新连接而成。该法的最大局限在于重组连接只能在具有合适酶切点或通过突变获得的酶切位点处进行。此外，产生的重组体往往会发生阅读框架移码或密码子改变等问题。用重组PCR构建重组体则可解决上述问题。 . 它的原理在于巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，共进行二级PCR反应。 . 在初级的两个PCR反应中，每对引物中的一个引物3端与待重组基因互补，5‘端与另一个待重组基因引物5’互补，即在引物的5‘端加入一段序列作为接头。 . 所得两种PCR产物有部分重叠序列，混合两种初级PCR产物进行次级PCR . 经过变性和复性，两种PCR产物通过互补序列发生粘连，出现两种异双倍体产物。 . 其中一种产物的3’末端单链可用Taq DNA聚合酶延伸，产生包含两个重叠产物全长的片段，作为PCR反应的模板。 . 由此进行PCR扩增，可产生一个包含两种基因的重组基因片段，该片段保持了密码子框架的正确性。 . 而另一种产物5‘末端单链不能延伸，成为无效模板，不能进行再次扩增。 . （二）突变体的构建 突变体的构建原理与重组体的构建相似。在靠近引物5端，人为造成引物与模板之间的碱基突变、插入或缺失。两个初级PCR产物均有PCR引物导入的同样的突变序列，因此有部分重叠序列，将两个初级PCR产物混合，进行次级PCR，即可获得突变体片段。 . 在靠近引物5端，人为造成引物与模板之间的碱基突变、插入或缺失。两个初级PCR产物均有PCR引物导入的同样的突变序列，因此有部分重叠序列，将两个初级PCR产物混合，进行次级PCR，即可获得突变体片段。 . 进行重组PCR时，加入较多的模板可降低单核苷酸的错误掺入率，纯化初级PCR产物，除去过量的内侧引物，再进行次级PCR，可提高反应的特异性。 重组PCR简化了传统重组体或突变体构建法中片段纯化、克隆、筛选等步骤，并缩短重组体构建的周期，必将得到越来越广泛的应用。 . 九、 Alu PCR Alu序列是人类基因组DNA中的特异性重复序列，估计人类基因组中，Alu序列大约有900000拷贝数，遍布于全基因组中，两个Alu序列之间的距离大约有4kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR方法称为AluPCR。 . 人类基因组Alu序列间可按相同的方向排列，也可按不同方向排列，进行PCR时所用Alu引物也不一样。如果两个A切的方向是相对的，用一个Alu引物就可扩增出中间的未知序列，如果两个Alu序列处于同一方向，则需用两个Alu引物，按常规PCR进行未知序列的扩增。 . 十、表 达 PCR 传统的体外转录翻译方法需经过目的基因克隆构建表达载体，将表达载体导入宿主细胞等多个步骤，相当烦琐。表达PCR（expression PCR）则是一种更加简便的体外转录翻译的方法。表达PCR是重组PCR的一种，是通过将调控启动子和高效转录终止子序列分别附加于两引物的5’端，扩增后使这些序列修饰待表达基因的5’和3’端。这种扩增产物可克隆入表达载体从而可获得这种基因的高效表达。 . 将启动子序列（5’-TAATACGACTCACTATA-3’）和目的基因重组，产生重组DNA，PCR扩增含有启动子序列的目的DNA片段，可直接进行体外转录产生功能性的蛋白质。 . 1991年，Kain等用表达PCR使含有噬菌体T7启动子的目的基因得以表达。T7启动子区域结构如下： 5‘-CCA AGT TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT TTT TAT TTT TAA TTT TCT TTC AAA TAC TTC CAC C（ATG）-