《免疫组化技术简介》.ppt

免疫组化技术简介 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 基本概念 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, ICC)。 免疫组化 基本概念 抗原（Antigen, Ag） 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。 抗体（Antibody, Ab） 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 基本概念 抗体的结构 V区氨基酸的种类和排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。（抗原特异性，第一抗体） C区氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定。 制备第二抗体的重要基础。 基本概念 单克隆抗体 由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。 多克隆抗体 由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原决定簇的多种抗体的混合物。 基因工程抗体 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成后导入受体细胞表达产生的新型抗体。 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 基本原理 抗原 显色 抗体 间接法 直接法 PAP法 LSAB法 基本原理 显色系统 酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物 辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC 碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP 酶的选择 HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 操作流程 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 技术要点 免疫原理的选择 一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式 技术要点 取材 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细胞有重叠） 各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹水等）。 培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。 取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。 组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。 技术要点 固定 目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。 注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。 固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。 甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。 技术要点 石蜡切片 优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。 冰冻切片 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成抗原的弥散使定位不准确。 能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻