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实验十 细菌的凝集反应 何伟 06－04 实验目的 了解血清学方法的原理 血清学方法在微生物诊断中的作用 学会利用血清稀释法测定免疫血清的效价。 实验原理 颗粒性抗原(如细菌或红血球)的悬液与含有特异性抗体的血清混合，在适量电解质存在的情况下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。参加反应的抗原称凝集原，其血清中的抗体，称为凝集素。凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。由于电解质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生了凝集现象。进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。 有些细菌即使用生化反应很难区别，但其细菌抗原成份（包括菌体抗原、鞭毛抗原）却不同。利用已知的特异抗体测定有无相应的细菌抗原可以确定菌种或菌型。常用的方法为玻片凝集反应，用已知的特异免疫血清与待鉴定的细菌在玻片上做凝集反应，如出现凝集菌团则为阳性，说明该菌有相应的特异抗原。检测抗原的另一优点为在应用了抗生素治疗后，细菌生长被抑制，利用培养方法不能检出的细菌，因尚有抗原存在，在短期内仍可被检出，从而有助于明确病因。个别情况下还可利用噬菌体对细菌抗原型别分析，用于流行病学追踪调查。 实验材料 大肠杆菌斜面培养物，大肠杆菌悬液(含10×109个／ml大肠杆菌的生理盐水悬液，并经60℃加热l h灭活)。 大肠杆菌免疫抗血清。 生理盐水、载片、小试管、试管架、移液管（1m1刻度、5ml）、水浴锅 实验步骤 玻片凝集反应(1)取洁净干燥的载片一片，用笔划分两区，一端注明为试验，一端注明为对照。(2)用接种环取生理盐水，置二滴于对照中心；同法滴大肠杆菌免疫血清于试验中心。(3)用接种环取少量大肠杆菌培养物分别研磨乳化于盐水及血清内，并均匀混合。(4)将玻片赂为反复摆动后静置于50 ℃恒温水浴表面上保温5～10 min。(5)观察是否有凝集块出现，如有则记为阳性，没有则记为阴性 试管凝集反应 此法为免疫血清定量测定效价法。(1)取清洁干燥的小试管10支，排列在试管架上。(2)用移液管加入生理盐水0.5m1于各试管中。(3)取免疫血清0.5m1加入另一试管，并加4.5ml生理盐水混合，制成稀释1:10的免疫血清。(4)用移报管吸取斜面培养18h的大肠杆菌培养物、稀释1：10的免疫血清0.5m1，注入第一管，并吸吹三次混匀；然后由依次吸取0.5m1注入第二管、第二管到第三管……如此类推到第九管为止。从第九管吸出o．5m1弃去，第十管不加血清，以作对照。 (5)在每管中加入0.5m1经处理的大肠杆菌菌悬液，作为抗原。摇匀，并置45℃水浴中2h后，初步观察结果，转置冰箱，次日再观察结果。观察结果时勿摇动试管。 实验结果 观察管底是否有凝集现象。记录结果①完全凝集，凝集块完全沉于管底，液体澄清，以“十十十十”记录。②凝集块沉于管底，液体稍混，以“十十十”记录。③部分凝集，液体混浊，以“十十”记录。④极少凝集．液体混浊．以“十”记录。⑤无变化记以“一”* 取“十十”的稀释度作为免疫血清的效价 问题与讨论 (一)凝集反应为何要在适量电解质存在的情况下才能进行? (二)生理盐水中的电解质在凝集反应中有什么作用? (三)试管凝集反应与玻片凝集反应各有什么优点? * * *