酶标抗体技术.docVIP

酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。 （一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术 　　辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。 　　HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。 　　凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。 　　用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。 1、改良过碘酸钠法 　　HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。 　　[标记步骤] 　　（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液0.1mL，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。 　　（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。 　　（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。 　　（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。 　　（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。 　　（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。 　　（7）将沉淀物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。 　　（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。 2、戊二醛交联法 　　戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，pH6.0～8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。 　　[标记步骤] 　　（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h。 　　（2）