分光光度法检测蛋白质含量.ppt

1．取试管3支，编号按下表操作 试 剂（ml） 空白 标准 标本 生理盐水 0.1 蛋白标准液(50ug／ml) 0.1 样 品 0.1 考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0 2.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测 定各管的吸光度。 【操作步骤】 3. 计算 A标本/A标准 ×50 （μg/ml） = 样品中蛋白质的含量（μg/ml） 注意：蛋白标准液浓度50 μg/ml 实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量 【基本原理】 由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。 灵敏度：50-100μg 【操作步骤】 （一）制作标准曲线 1.取试管6支，编号，按下表操作。 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调“0” ，在280nm波长下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图。 （二）标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测A280标准曲线上读出浓度。 颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中用PBS清洗。 称取100mg肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中。 将1mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中。 离心（13000rpm，5min），取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。 小鼠肝脏组织总蛋白的提取 注意：实验一用原液，实验三和实验四将原液进行50倍稀释。 实验安排 1.获得蛋白样品：自己提取蛋白。 2. 蛋白含量测定： 上午完成1-2个实验，下午1-2个。 生物化学与分子生物学实验 曾季平 生物化学与分子生物学系 生物化学与分子生物学实验 实验室规则 实验室安全及防护 实验室常用玻璃仪器 实验考试 实验室规则 提前5分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退一次扣1分，每旷课一次扣5分。 禁止在实验室内吃食品，如有违反者按迟到处理。 上课必须穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验室。 实验期间手机必须设置在振动上，上课期间如急需接、打电话请到走廊上处理。 在实验室内要保持安静，不得嬉闹、大声说话。 认真预习 认真做实验 养成良好的实验习惯（实验中、实验结束后） 值日生工作 实验室安全及防护 预防火灾 预防中毒 外伤 实验室常用玻璃仪器 吸量管***(示教) 试管 烧杯 量筒 实验考试 实验课成绩 平时表现 实验测验 原理 实验报告 ----格式 结果 操作考试 分析 实验报告网上提交 实验报告采取网上提交的方式，实验报告提交时间设定为3天，即本次实验结束后第三天晚上12点之前提交，过期无法再提交，本次实验报告则记为0分。 尽早提交报告，不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去。 直接将报告粘贴在框中，切记不要以附件方式上传，否则有可能文件打不开，影响成绩。 不要相互抄袭，一旦发现雷同卷则均记为0分。 若过期没有提交报告，不要将报告发到老师邮箱，发也没用，最终实验报告成绩只记系统导出的成绩。 实验一 分光光度技术及蛋白含量测定 理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造 实验: 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量 一、概念 利用物质特