实验 植物DNA提取及检测.ppt

植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 六、作业 为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？ 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 DNA分子量标准 不同种类DNA Marker 1.凝胶制备 制备1%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖加入 80mL 1×TAE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB或GoldViewTM 10ul。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取15μl DNA样液与 2μl 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照 四、操作步骤 紫外仪上观察电泳带及其位置。 绘制核酸电泳示意图。 五、作业 植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测 一 、实验目的 学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。 脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。 二、实验原理 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸 基本过程 ①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA提取 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 DNA纯化（去杂质） 实验材料 植物叶片(去叶脉) 试剂 2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、Nacl） TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 巯基乙醇 异丙醇 70%乙醇 三、材料与试剂 ①离心机 ②水浴锅 ③研钵 ④微量移液器 仪器用具 移液器－量程的选择 1．取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研磨。将2×CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65℃水浴中加热30分钟。 2．将 0.5mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，加入1ml CTAB提取液，置于65℃水浴中保温 30min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞 3. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀20分钟，防止成团。8000r/min，离心 5min，取上清。抽提去蛋白 4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇（预冷）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸 5．8000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于无菌水或 TE 缓冲液待测。 四、操作步骤 1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料； 3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难； 4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。 五、注意事项 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。 二、实验原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 三、实验仪器和试剂 仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 Tris-硼酸（TBE） Tris-