电泳测定法课件.ppt

两性电解质载体是由许多种多乙烯多胺(如五乙烯六胺等)与丙烯酸进行加成反应而制备得到的混合物。Ampholine，Pharmalyte等，相对 分子质量为300～1000，有不同的pH范围。如 pH3.5～5、5～7、6～8、3～10、9～11等。 2.稳定pH梯度的形成 在等电点聚焦电泳中，阳极槽装酸液(如硫酸、磷酸溶液等)，阴极槽装碱液(如氢氧化钠、乙二胺等)。当槽中加入两性电解质载体时，则这些两性电解质载体在阳极的酸液中得到质子而带正电荷，在阴极的碱液中则失去质子而带负电荷。接通电源后，这些带电粒子受到电场的作用，向其所带电荷相反的电极方向移动。 假设在阴极槽中有一种等电点较低的组分A和另一种等电点稍高的组分B，组分A和B在阴极槽都带负电荷，向阳极运动，当A逐渐接近阳极到达某一位置时就会得到质子而停止移动；组分B在移动到靠近组分A的位置时也会得到质子而停止移动，此时，B处在A和阴极之间。 阳极槽 阴极槽 A和B A B 电泳测定法 生物药物分析测定方法 电泳测定法 电泳测定法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，在电场的作用下，带电粒子按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外，各电泳法，照下述方法操作。 按支持物 纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 按凝胶形状 水平平板电泳 园盘柱状电泳 垂直平板电泳 试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6) 称取巴比 妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解使成 1000ml。 (2) 氨基黑染色液 称取氨基黑10B 0.5g，溶于醇50ml、冰醋酸l0ml及水40ml的 混合液中。 (3) 漂洗液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml 及水50ml，混匀。 (4)透明液 量取冰醋酸25ml、无水乙醇 75ml，混匀。 醋酸纤维素薄膜电泳法 测定法 取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上，通过滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5％的供试品溶液2～3ul，在0.4～0.6mA/cm[总电流量：电流量(mA/cm)×每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳。 项 目 品 种 醋酸纤维素薄膜 电泳 纯度检查 人血白蛋白 ≥96.0% 人免疫球蛋白 ≥90.0% 乙型肝炎人免疫球蛋白 ≥90.0% 狂犬病人免疫球蛋白 ≥90.0% 破伤风人免疫球蛋白 ≥90.0% 静注人免疫球蛋白 ≥95.0% 抗人T细胞猪免疫球蛋白 ≥90.0% 试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8.6) 称取 巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g，加水适 量，加热使之溶解，放冷至室温，再加 叠氮钠O.15g，溶解后，加水稀释成 1500ml。 (2)1.5％琼脂糖溶液 称取琼脂糖 1.5g，加水50ml和巴比妥缓冲液(pH8.6) 50m1．加热使完全溶胀。 琼脂糖凝胶电泳法 (3) 0.5％氨基黑溶液 称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。 (4) 脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5m1及水50ml，混匀。 (5) 溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使之溶解，并稀释成100ml。 对照品 正常人血清或其他适宜的对照品。 供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液 将供试品稀释成蛋白质浓度为1％～2％的溶 液。 测定法 趁热将1.5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，其厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极端的1/3处打孔，孔径2～3mm。置含有巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上，测定孔加适量供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及l滴溴酚蓝指示液。 用3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8.6) 接触，100V恒压条件下电泳2小时(指示 剂迁移到前沿)。电泳结束后，用0.5％ 氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背 景无色。 项 目 品 种 琼脂糖胶凝 电泳 纯度检查 白喉抗毒素 应不含或仅含痕量白蛋白迁移率的蛋白质成分 破伤风抗毒素 同上 多价气性坏疽抗毒素 同上 肉毒抗毒素 同上 抗蝮蛇血清 同上 抗眼睛蛇毒血