动物细胞培养基本技术与原理课件.ppt

2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。 3）有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物--原代培养（primary culture） 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。 “代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。 永久细胞系有如下特征： 细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比； 生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。 4）动物细胞的环境敏感性 动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。 动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。 三、动物细胞的环境要求 1. 动物细胞培养的环境要求 1）无污染环境 2）温度 昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。 3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。 4）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。 5）渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 培养基的渗透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。 四、动物细胞培养 基本概念和基本步骤: 取材分离和组织消化 细胞计数 常用培养法 细胞的常规检查 细胞系与克隆 动物细胞的大规模培养 细胞的冻存与复苏 一、基本概念（general concept）： 细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。 原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。 传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。 二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion ) （一）取材——获取组织 原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录； 所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。 取材方法: 处死动物 → 取出组织块，放入小烧杯中 → 用尖嘴眼科剪刀 将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的