FISH杂交技术课件.ppt

荧光原位杂交（FISH） Fluorescence in situ hybridization;原位杂交（ISH）;基本原理;原位杂交常用的标记物质;几种原位杂交技术;FISH发展;FISH发展; 20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。 ;FISH原理;荧光原位杂交特点;FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高; FISH的实验周期短,探针稳定性高; FISH能通过多次免疫化学反应,使其杂交信号明显增强,从而提高灵敏度,检测的灵敏度接近同位素探针杂交； FISH的分辨率高达3~20Mb； FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序,从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究。;实验流程;植物染色体常规制片;染色体制片;间期;前期;中期;后期;末期;小麦染色体制片;探针制备; 3.寡核苷酸探针 为人工合成的DNA片段，一般长约20-50个bp（碱基）。可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。DNA自动合成仪的出现使探针的合成十分方便。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。 ; 4.RNA探针 制备的技术路线为：将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA，在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的DNA探针要高。 RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。; 5.肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺)。与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成，而且合成费用高，因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。;PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则;探针设计与特异性; 以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb－400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原－抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。 ;探针设计;探针类型;染色体涂染探针：判断易位染色体;探针标记;探针标记;标记探针的物质;探针标记; 对探针进行标记时，可复制合成一段新的探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。;切口平移法： 先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌DNA聚合酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模板序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。;切口平移标记法;切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不能太小。 B.DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板