毒物分析-第五章课件.ppt

二、酶联免疫法（ ELISA ） (enzyme linked immunosorbant assay) （一）、基本原理 酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 测定方法中3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物。 第五章 毒物分析常用方法-免疫分析 放射免疫分析(Radio Immunoassay,RIA):是一种将同位素放射测量与免疫原理相结合的分析方法。 用于微量分析，定量测定受检标本中的抗原,检测限达到pg级(1×10-12g)。 酶标免疫分析(Enzyme -Labled Immunoassay,EIA)。 用酶标代替放射性同位素标记。无放射危害，操作方便、安全。 （一）、基本原理 放射性核素标记的抗原(radionuclide labeled antigen)和非标记抗原(unlabeled antigen)（标准抗原或被测抗原）同时与限量的特异性抗体(specific antibody)进行竞争性免疫结合反应(competitive immune binding reaction)，其竞争关系可用下式表示： 一、放射免疫分析 Ag*-Ab 标记抗原－抗体结合物 Ag* + Ab + Ag Ag-Ab 游离非标记抗原 非标记抗原－抗体结合物 　　假设受检标本中不含抗原时的反应条件为： 　　4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）（2） 根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。 　　在标本中存在抗原时，举例如下： 　　4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→ 　　1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）（3） *Ag与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力，当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时,两者相互竞争结合特异性抗体。 当*Ag和Ab为恒定量，Ag和*Ag的总量大于Ab上的有效结合点时，*Ag-Ab的形成是随着Ag量的增加而减少，剩下来的未结合或游离的*Ag则随着Ag量的增加而增加，称为竞争结合反应(competitive binding reaction) 抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比因此测定*Ag-Ab或*Ag的放射强度即可推出被测的Ag量。 若将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开，分别测定其放射性强度，就可计算结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）的比值（B/F），结合率[B/(B＋F)]，这与标本中的抗原量呈函数关系。 用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。 RIA标准曲线 　标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。 γ射线主要为131I、125I、57Cr和60Co β射线有14C、3H和32P 放射性核素的选择首先考虑比活性。 例如125I比活性的理论值是64.38×104GBq/g,有较长半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g，1mol125I或14C结合到抗原上，125I的敏感度约比14C大3900倍。125I有合适的半衰期，低能量的γ射线易于标记，常用的RIA标记物。 1、标记物 2、标记方法 　　标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。 直接标记法:将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。 优点： 操作简便，为125I和蛋白质的单一步骤的结合反应，它能使较多的125I结合在蛋白质上，故标记物具有高度放射性。 只能用于标记含酪氨酸的化合物。 含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。 间接标记法（又称连接法）是以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。 特点： 操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。 但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。如直接法标记引起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时，也可采用间接法。 它的标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。 例 氯胺T直接标记法。 　　 氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐，在