第六章酶工程课件.ppt

分子印迹酶 1．分子印迹概念：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程 2. 分子印迹技术内容 选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应 在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应 用抽提法从聚合物中除掉印迹分子 3．分子印迹酶 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。 性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。 生物印迹 生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。 非水相生物印迹酶制备示意图 抗体酶 一、抗体酶的概念 二、抗体酶的催化特征 三、抗体酶的催化作用机理 四、抗体酶的催化反应类型 五、抗体酶的制备方法 六、抗体酶的应用 抗体酶的概念 抗体酶 或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。 二、抗体酶的催化特征 1. 与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应 有更强的专一性和稳定性 催化作用机制不同 2. 抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性 反应的可逆性 反应的量效性 反应过程 三、抗体酶的催化作用机理 1、过渡态理论与抗体酶 2、抗体酶催化的三种重要反应机制 水解作用机制 基团转移 连续反应机制 3、抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。 脱羧反应中介质效应 ：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。 三、抗体酶的催化反应类型 1. 转酰基反应 2. 水解反应 3. Claisen重排反应 4. 酰胺合成反应 5. Diels-Alder反应 6. 转酯反应 7. 光诱导反应 8. 氧化还原反应 9. 脱羧反应 10. 顺反异构化反应 四、抗体酶的制备 1. 细胞融合法：用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。 2. 抗体结合位点化学修饰法：抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。 * 酶和细胞的固定化 定义 酶的固定化 细胞的固定化 应用 固定化酶 是指在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶的特点 可以多次使用，稳定性提高 易于提纯，产品质量高 易于控制，实现连续化和自动化控制 酶利用率高 比水溶性酶更适于多酶反应 酶的固定化 载体结合法 将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。 交联法 通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。 包埋法 将酶包裹在多孔的载体中 优点： 固定化时酶分子的构象很少 或基本不发生变化。 缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、 沸石及硅胶等。 离子结合法 含有离子交换基团的固相载体 第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 二、包埋法 凝胶包埋法 首先被采用的凝胶包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 ?－淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation 包埋法—微胶囊法 常用材料： 聚酰胺膜 火棉胶 硝化纤维 聚苯乙烯 壳聚糖等 微胶囊固定化酶制备方法 界面聚合法 将酶水溶液和亲水单体用一种与水不溶的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一种有机溶剂的疏水单体溶液边搅拌边加入到上述乳化液中，在乳化液中的水相和有机相之间的界面发生聚合作用，酶即被包埋于聚合体膜中。 液体干燥法 将一种聚合物溶于一种沸点低于水且与水不溶的有机溶剂中，加入酶的水溶液，以油溶性表面活化剂，制成第一乳液。把它分散于含有保护性胶质、聚丙烯醇和表面活性剂