蛋白质与酶工程课件.ppt

第七章 酶(蛋白质)的基因水平分子改造 （蛋白质工程） 基因水平的蛋白质分子改造是采用定点突变对蛋白质编码基因进行改造，改变蛋白质的氨基酸获得具有预期性状的蛋白质。 ;第一节 概述 一、基因水平分子改造的基本程序 第一，分离纯化需改造的目标蛋白； 第二，目标蛋白的序列分析、结构分析和功能分析； 第三，分子设计和结构预测（计算机模拟）； 第四，分离克隆目标蛋白的编码基因； 第五，基因定点突变； 第六，突变基因的表达载体构建与表达 第七，突变蛋白的分离纯化与功能检测 ;二、基因水平分子改造的基本内容 ①改变酶促反应的Km与Vmax，可改变反应的催化效率； ②改变蛋白的pH值或温度稳定范围，可改变蛋白的作用条件； ③改变蛋白在非水溶剂中的反应性，可使蛋白在非生理条件下作用； ④改变某种酶，使其不再需要加入辅助因子，简化持续生产过程；; ⑤提高酶对底物的亲和力，以增强酶的专一性，减少不必要的副反应； ⑥增强蛋白对胞内蛋白酶的抗性，可简化纯化过程，提高产率； ⑦改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，使产物的产率提高； ⑧提高蛋白的抗氧化能力； ⑨根据需要改变酶的底物专一性； ⑩改变蛋白发生作用的种属特异性。;第二节 蛋白质的结构和功能分析 一、蛋白质结构分析 蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）已收集了数万个蛋白质的晶体结构。 对于PDB中没有收录或未见文献报道的蛋白质，其结构分析可通过以下方法获得： 晶体学技术：ｘ射线晶体技术、中子衍射技术、电子晶体技术——蛋白质晶体构象 波谱学技术：多维核磁共振（NMR）、电子自旋共振——蛋白质溶液构象 蛋白质结构预测：根据蛋白质的氨基酸序列构建出蛋白质的立体结构模型。;第三节 酶（蛋白质）的分子设计 酶（蛋白质）分子设计就是以酶（蛋白质）结构预测为基础设计一个针对性地改造酶（蛋白质）分子的方案。 一、分子设计的类型 ;二、分子设计的原理 1、内核假设 内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。内核由氢键连接的二级结构单元（α螺旋或β折叠）组成，氢键都是最大化的。内核都是致密堆积的疏水区(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。 2、疏水或亲水氨基酸需要合理地分布 疏水性氨基酸通常出现在蛋白质的活性中心区域；环区、转角区和带电荷区通常位于蛋白质的表面，或在底物结合区和配基结合区。 ; 3、注意保留脯氨酸、半胱氨酸残基 脯氨酸是终止α螺旋区，两半胱氨酸常形成起稳定作用的二硫键。 4、注意保留活性中心区的保守氨基酸残基 5、注意保留潜在的N糖基化位点（Asn-X-Ser／Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr。 6、在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位的几何要求（键长、键角）;三、分子设计的程序 1、以蛋白质的三维结构为基础，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸； 2、利用能量优化及蛋白质动力学方法预测改造后的蛋白质结构； 3、预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构-功能或功能-稳定性相关知识及理论计算，预测新蛋白质可能的性质和功能。;第四节 基因定点突变 寡核苷酸介导法 PCR突变法 盒式突变法 DNA shuffling（结构域互换、片段重组） 一、寡核苷酸介导法 寡核苷酸介导法是指通过突变寡核苷酸引物在DNA合成中引起目的基因特定位点发生核苷酸插入、缺失或取代等突变。 ;1、原理与程序; 2、突变寡核苷酸引物的设计原则 ①必须与模板链上的目标DNA序列互补； ②必须足够长以便特异地与目标 DNA序列退火； 单个核苷酸改变：17nt~19nt 两个以上毗邻核苷酸改变：＞25nt ③突变核苷酸应位于引物中央； ④应避免可形成稳定二级结构； ⑤不能同模板的非突变区段形成稳定的杂交体。; 3、具体操作方法 ①单引物法 突变引物 ②双引物法 突变引物、通用的测序引物 以上两种方法的突变率只有1%~5% ③Kunkel突变法 双引物、dU-模板，突变率达80% 以上;;二、PCR突变法 利用PCR技术在体外进