实验1 总酚类黄酮联合测定2010课件.ppt

植物体内总酚、类黄酮含量的联合测定 植物次生代谢与工程实验 张 海 森 山东农业大学 生命科学学院 酚(phenol)，通式为ArOH，是芳香烃环上的氢被羟基(—OH)取代的一类芳香族化合物。最简单的酚为苯酚。 酚类物质属于具备防御功能的次生物质，酚类物质能够有效清除自由基；有些植物自身含有的酚类物质能够对其它植物产生抑制作用，从而维护自己种群的稳定性。同时，酚类物质还可使植物减少遭受昆虫或病原微生物危害的几率。类黄酮属于酚类物质，广泛存在于许多植物组织中。 分类：依分子中羟基数分为一元酚、二元酚及多元酚；羟基在萘环上的称为萘酚，在蒽环上称为蒽酚 一、目的意义 二、原理 多酚与FoLin-Ciocalteu试剂发生特异性反应，反应产物对特定波长有最大吸收，且吸光值与多酚的量在一定浓度范围内成线性关系。 类黄酮具有 C6–C3–C6碳骨架结构，黄酮类分子中具有酚羟基，可与Al3+在碱性溶液中显色，在一定浓度范围内，其浓度与吸光度符合朗伯-比耳定律，可进行比色定量。 黄酮类化合物--基本母核为2-苯基色原酮 三、器材与试剂 仪器： 分光光度计，恒温水浴，25ml具塞试管，10ml试管，移液器，漏斗，滤纸等。 试剂： Folin-酚试剂， 20% Na2CO3， 5%亚硝酸钠， 10% 硝酸铝，4％氢氧化钠， 50%甲醇等。 五、操作步骤程序： 1、样品提取 2、总酚含量测定 3、类黄酮含量测定 4、标准曲线的绘制 5、结果计算 1、样品提取步骤 取烘干的雪松叶(或银杏叶)， 粉碎，过40目(0.63毫米 )筛 称取0.20g干样置入20ml具塞试管中， 加入10ml 50%甲醇， 盖塞，摇床振荡提取10h 过滤于25ml容量瓶，50%甲醇冲洗定容 得到酚类物质的粗提液 过滤时，滤纸先用吸管吸取50％甲醇润湿 2、总酚含量的测定 取4支具塞试管（3支测定管，一支空白管） 3支测定管加入过滤的粗提液0.2ml， 1支空白管加同量50％甲醇 各试管中加入4.8ml蒸馏水 加入0.5ml的 Folin-酚试剂，摇匀 8分钟内加入20% Na2CO3 2.5ml，摇匀 50℃恒温水浴下避光保温30分钟 760nm下测定吸光度 （以单宁酸为标样制作标准曲线） 3、类黄酮含量的测定 取4支具塞试管（3支测定管，一支空白管） 3支测定管加入过滤的粗提液 1ml， 1支空白管加同量50％甲醇 各管加0.5ml 5% NaNO2， 摇匀，静置5min 加0.5ml 10% Al(NO3)3，摇匀，静置6 min 加2ml 4％ NaOH，混匀，放置10min 510nm下测定吸光度 （以芦丁为标样制作标准曲线） 黄酮铝络合物易受CO2作用使颜色有所变化，要求短时间完成操作，中间盖塞 4、标准曲线的绘制 吸取100mg/LD单宁酸标准贮备液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别放入8只100ml容量瓶中，加水至75ml，再加5ml的Folin-酚试剂和10ml20% Na2CO3,混合后定容。即得到系列标准液。放置30min后用760nm波长比色测定。以单宁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 总酚含量（μg/g）=X×V /m X为由吸光度按标准曲线查的结果；V为粗提液总体积 (ml)；m为称样质量(g ) （参考）总酚的标准曲线：y = 0.0026x + 0.0245 R2 = 0.9993 5、结果计算 类黄酮含量（μg/g）=X×V /m X为由吸光度按标准曲线查的结果；V为粗提液总体积(ml)；m为称样质量(g) （参考）类黄酮的标准曲线：y=0.8965x – 0.0014 R2 =0.9997 附 722型可见光分光光度计使用 1.开机预热3-5分钟。 2.闭盖，黑体，调100% 3.闭盖，用空白代替黑体，调0 植物体内总酚和类黄酮含量测定数据记录表 波长(nm) 称样量(g) 1 2 3 平均值 含量(μg/g) 总酚 类黄酮 ? 结果记录：请老师检查原始数据 用品洗刷干净，检查摆放整齐、齐全 报告老师，经检查同意可离去 值日生负责注意: