毒物分析第五章课件.ppt

新疆医科大学药学院药分/分析教研室 新疆医科大学药学院药分/分析教研室 * 第五章 毒物分析常用方法-免疫分析 1959年Berson等建立放射免疫分析(Radio Immunoassay,RIA)，是一种将同位素放射测量与免疫原理相结合的分析方法。用于微量分析，检测限达到pg级(1×10-12g)。 1971年Engvall等在RIA的基础上,建立酶标免疫分析(Enzyme -Labled Immunoassay,EIA)。 用酶标代替放射性同位素标记。无放射危害，操作方便、安全。 1，基本原理 免疫分析的本质是抗原(Antigen,Ag)-抗体(Antibody,Ab)的竞争结合反应。 将纯化的待测物质标准品作为抗原,免疫动物，使其产生特异性抗体，然后根据Ag与其标记物（*Ag：标记抗原）对Ab的特异性竞争结合的程度测定Ag的含量。 由于Ag和*Ag对Ab具有同等的亲和力，因此在免疫反应中，当*Ag，Ab浓度恒定，并且[*Ag]＞[Ab]时，若加入Ag将发生以下反应： 设：F/B=1:1 2*Agt + 2Agt + 2Ab → *Agf + Agf + *AgAb + AgAb 在系列试管中加入规定量*Ag、Ab，再依次加入已知不等量Ag，培育后分离Agf 与AgAb，测定放射活性。以B/F或F/B作纵座标，对Agt作图。据此可测定未知Ag浓度。 RIA标准曲线待测物浓度(Ag,conc.)与所测得的反应计量值(*Ag-Ab)呈反比 2.2，标记 ⑴、放射性同位素标记 通常半抗原先与酪氨酸偶合，然后标记。目前最常用的放射性同位素是碘-125（半衰期60天，含量：95﹪，能量低：约40 KeV）。或3H标记Ag。能谱仪检测（3H标记，用液闪测定）。 ⑵、酶标免疫分析 用特异性酶作标记，例如吗啡用苹果酸脱氢酶(malate dehy -drogenase,MD)标记，形成吗啡-MD。测定时被测吗啡与吗啡-MD竞争性结合吗啡抗体。由于吗啡-MD结合愈多其活性愈小，测定底物浓度即可计算分析物含量。 名 称 来 源 分子量 底 物 测定方法 溶菌酶 鸡蛋清 14000 细胞壁 比色法 葡萄糖淀粉酶 酵母 淀粉 比色法 辣根过氧化物酶 辣根 40000 H2O2/5-氨基水杨酸 比色法 b-半乳糖苷酶 大肠杆菌 51800 邻硝基酚 比色法、荧光法 2.3、抗体产生 抗体的产生是RIA的关键，通常用50-100mg抗原加佐剂混合后给家兔、豚鼠或羊等动物全身多点皮下注射（或脚底、皮内、肌肉等）。注射适当次数后取血做滴度测定。由于纯化抗体困难，因此用抗血清(Antisera)代替。 2.4、标准曲线制备 放射免疫分析 A，根据待测样品的最低浓度及滴度曲线，选定Ab稀释度，在一系列试管中加入等量的*Ag及抗血清。然后加入不同浓度的标准Ag进行培育（在pH7.4磷酸盐-三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，37℃进行）； B，通过活性炭、硅藻土或凝胶柱使*Agf 及*AgAb分离。 C，清液测定放射活性，以B/F或F/B对Ag浓度作图。 * * 新疆医科大学药学院药分/分析教研室