生物制药1121聚丙烯酰胺凝胶电泳分离丙种球蛋白课件.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离丙种球蛋白;作用原理;实验原理;制备丙种球蛋白的方法;聚丙烯酰胺凝胶电泳;制备聚丙烯凝胶的配方;聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白;（2）丙种球蛋白的制备过程; ③染色和脱色:电泳结束时,用双蒸水把胶面洗净。置于染色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯亮蓝G250)中,50～60r/min,振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面,转至双蒸水脱色,1h。更换双蒸水2~3ci直到背景清晰。;（3）结果分析;注意事项：;聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法;实验仪器 1. 电泳仪 2. 电泳槽 3. 注射器 4. 长针头 5. 吸管 6. 培养皿;实验试剂 1. 三羟甲基氨基甲烷（简称Tris） 2. 贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。 3. 染色液： 0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。 4. 脱色液：7%醋酸溶液。 5. 电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml. 6. 示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。; 实验步骤 1.制胶： 取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。 1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）： 将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。 2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7 ，浓缩胶）： 将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。 加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。 然后胶管于烘箱中25℃~35 ℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。 ; 2.安装胶管 把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。 注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。 先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。;3.加样 0.5ml新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释（有老师配制） 。用微量注射器或移液枪向胶管内加20ul样品液，注意微量注射器或移液枪头??插入胶管内加液。;4.电泳 上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。 当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。;5.剥胶 取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。;6.染色及洗脱 A.将取下的胶条放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考马斯亮蓝水溶液染色15min，7%醋酸过夜保存。 B.将取下的胶条放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡过夜。 注:染液回收; 7.观察绘图 将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。;注意事项