万古霉素产生菌的分离及育种课件.ppt

一株万古霉素产生菌的分离及育种 文献来源：厦门大学学报 文献作者：王明兹、黄翠莲、吴莹莹 万古霉素的产生菌的选育 技术路线 实验内容 实验对象：一类稀有放线菌——拟无枝酸菌 基本原理： 运用分子育种中的基因组重排技术技术选育万古霉素高产菌 实验方法 得出结论 技术路线图 实验内容 研究背景 近年来，由于链霉菌中大量的抗生素不断被重复发现，继而人们把研究的重点转向稀有放线菌(rare actinomycetes)。拟 无 枝 酸 菌属（Amycolatopsis)就是一类非常重要的稀有放线菌，产生万古霉素和利福霉素等重要临床药物，以及其他抗菌、抗肿瘤等代谢产物。 万古 霉 素 （vancomycin）是 由 McCormick等 于1955年从一株东方拟无枝酸菌（A.orientalis）的发酵液中分离得 到 的 一 种 糖 肽 类 抗 生 素。它能够抑制革兰氏阳性菌的生长，而对厌氧菌和革兰氏阴性菌无效。1958年 获 FDA批准上市.它 是 治 疗 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）等引起的严重或致命感染的重要药物，对多重耐药性肠球菌感染性疾病也有突出疗效. 通过利用菌株的形态特征、生理生化特性和分子生物方法从土壤中分离万古霉素产生菌，并采用育种技术选育具备工业化潜力的万古霉素高产菌株，为进一步研究奠定基础。 实验材料 1.万古霉素产生菌：东方拟无枝酸菌 ＸＭ０３０１由本实验从厦门集美土样中分离． 2.指示菌：枯草芽孢杆菌和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 购自中国医学细菌保藏管理中心．　 3.培养基枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：ＬＢ培养基。拟无枝酸菌分 离 培 养 基：高 氏 一 号 培 养 基（含有万古霉素５０ｍｇ／Ｌ、重铬酸钾５０ｍｇ／Ｌ 和制霉菌素５０ｍｇ／Ｌ），ＸＭ０３０１发酵培养基 实验步骤一 出发菌株获取 1.菌株的分离筛选 样品采集 土壤样品采自厦门海沧（１）和集美（２） 富集培养 称取样品，加入无菌水，制成土壤悬浊液，梯度稀释．分别取各个梯度稀释样品采用混菌法制成分离平板，２８ ℃培养． 分离筛选 挑取分离平板上的放线菌菌落，用划线法转接到新鲜的无菌高氏平板，２８ ℃恒温箱培养，形成纯的单菌落后再转接到新鲜高氏斜面培养保藏。 结果 通过利用制霉菌素、重铬酸钾和万古霉素分别抑制真菌、细菌和链霉菌等杂菌生长，高效地富集稀有放线菌，从来自厦 门集美的 ２ 号土样中分离 出XM0301 ，在高氏培养基上为草帽型放射状菌落，白色孢子。 2.菌株鉴定 观察菌丝形态、产孢结构和孢子形态 分离菌株形态特征于葡萄糖天冬酰胺琼脂、马铃薯浸汁琼脂、高氏一号琼脂和 ＹＥＭＥ 培养基上 ２８ ℃插片培养５～７ｄ，镜检。 １６ＳｒＤＮＡ 鉴定 设计引物进行PCR扩增，纯化PCR产物并测序。序列用NCBI blast,与GenBank相关序列比对分析。 结果见表1和表2 3.生物活性鉴定 采用抑菌圈法，分别以枯 草 芽 孢 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 指 示菌，测定分离菌株发酵液抗菌活性． 综合培养、形态、生理和生化等特征，初步判定筛选的 XM0301为 拟 无 枝 酸 菌 属，进 一 步 测 定 其 16SrDNA 序列［NCBI登录号为DQ990889］，与无枝酸菌属相似性达 100％，比对分析结果表明 XM0301为一株东方拟无枝酸菌。 4.产物鉴定 根 据 Ｄｉａｎａ等 方 法修 改 设计ＨＰＬＣ 条 件 ，以Ｓｉｇｍａ公 司 盐 酸 万 古 霉 素 为标 样 分别采用保留值法和内标法对XM0301发酵产物进行HPLC测定． 通过 ＨＰＬＣ 分析，ＸＭ０３０１发酵液主要产物保留时间为6.2min左右（图Ｂ），与万古霉素标准样品的保 留 时 间 一 样 （图Ａ）．进 一 步 采 用 内 标 法 比 较 分析，在XM0301发酵液中添加万古霉素为内标后，6.2min峰强度明显增强，其他各峰基本不变，XM0301的主要产物为万古霉素，含量为860μｇ/mL（Ｂ、Ｃ）. 实验步骤二 获得高产菌株 通过育种技术提高万古霉素产生菌株的产量和产率，是获得更大经济效益的另一途径．本文采取原生质体诱变和基因组改组（基因组重排）技术选育万古霉素高产菌株。 基因组改组技术是结合经典诱变育种和原生质体融合技术发展起来的一种育种新手段，在诱变产生遗传多质性的基础上，通过多亲本原生质体融合，使带有不同基因位点正向突变的数个亲本杂交，基因重组产生新的复合子，然后进