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实验 胡萝卜素的柱层析分离1.doc
胡萝卜素的柱层析分离法
一、实验目的
1.了解吸附层析法的基本原理及应用。
2.掌握吸附层析的基本操作技术。
二、实验原理
????胡萝卜素存在于辣椒和胡萝卜等黄绿色植物中,因其在动物体内可转变成维生素 A ,故称为维生素 A 原。胡萝卜素可用酒精、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来,且能被氧化铝( Al 2 O 3 )所吸附。由于胡萝卜素与其它植物色素的化学结构不同,它们被氧化铝吸附的强度以及在有机溶剂中的溶解度都不相同,故将提取液利用氧化铝层析,再用石油醚等冲洗层析柱,即可分离成不同的色带。同植物其它色素比较,胡萝卜素吸附最差,跑在最前面,故最先被洗脱下来.
三、实验材料
1. 材料:
新鲜红辣椒(或干红辣椒)
2. 试剂
(1)95%乙醇
(2)石油醚及1%丙酮石油醚(1:100,体积比)
(3)Al2O3(固体)
(4)无水硫酸钠NaSO4
(5)三氯化锑氯仿溶液(称取三氯化锑22g,加100 mL氯仿溶解后,贮于棕色瓶中)
3. 器具
剪刀,研钵,试管,量筒 100mL ,吸管 5mL ,分液漏斗100 mL,小烧杯100mL,玻璃层析住(1cm×16cm),滴管,铁架台,蒸发皿、恒温水浴锅,天平,玻璃棒,棉花,滤纸。
四.实验操作
1 .提取
方案一:称取新鲜红辣椒 12g 左右(或干红辣椒 2 ~ 3g ),去籽剪碎后置研钵中研磨。加入95%乙醇 4 mL ,研磨至提取液呈深红色,加入丙酮 4 mL 继续研磨至成匀浆,加入蒸馏水 20mL 。混匀后,以四层纱布(或棉花)过滤,收集全部滤液至分液漏斗中,加入石油醚 6mL ,振荡数次后静置片刻。弃去下面的水层,再以蒸馏水 20 mL 洗涤数次,直至水层透明为止,借以除去提取液中的乙醇。将桔黄色的石油醚层倒入干糙试管中,加少量 NaSO4 除去水分,用软木塞塞紧以免石油醚挥发。
方案二:取干红辣椒皮2g,剪后放入研钵中,加95%乙醇4mL,研磨至提取液呈深红色,再加石油醚6mL研磨3~5min,此时,若石油醚挥发过多,可再加4mL左右,提取液颜色愈深则表示提取的胡萝卜素愈多。将提取液先用纱布过滤,再置分液漏斗中,用20mL的蒸馏水洗涤数次,直至水层透明为止,借以除去提取液中的乙醇。然后将红色石油醚层倒入干燥试管中,加少量无水硫酸钠除去水分,用软木塞塞紧试管口,以防石油醚挥发。
2 .层析柱的制备
?取直径为1cm×16cm的玻璃层析柱并垂直安装在铁架台上,在其底部放少量棉花,然后自柱的顶端沿管内壁缓缓加入石油醚-氧化铝悬浮液至柱顶部,待氧化铝在柱中沉积约10cm时,于其柱床上铺一张略小于层析柱内径的圆形的小滤纸(或棉花)。(装柱要均匀,无断层,柱床表面要水平)。
3.层析
????用细吸管取样品-石油醚提取液1ml,沿柱内壁缓缓加入(注意切勿破坏柱床面),待样品-石油醚提取液全部进入层析柱时立即加入含1%丙酮石油醚冲洗,使吸附在柱上端的物质逐渐展开成为不同的色带。仔细观察色带的位置、宽度与颜色,并绘图记录。跑在最前方的桔黄色带即为胡萝卜素,待该色素接近层析柱下端时,用一试管接收此桔黄色液体,然后倒入蒸发皿内,于 80 ℃
五.注意事项
1 .对新鲜红辣椒等实验材料的研磨一定要仔细,以彻底破坏植物细胞以释放胡萝卜素,实验中加入 4mL 丙酮有利于对胡萝卜素的提取,此法可分离得到 5 ~ 6 条色带,最前面的色素为胡萝卜素(若分离条件控制得好,该色带又可分离成三条较小的色带,分别为 a , b 和 g 胡萝卜素),紧随其后者分别为蕃茄红素和叶黄素等。
2 .附剂的活性和吸附剂的含水量有关,若先用高温处理( 350 ℃~ 400
3 .装柱时,不能使氧化铝有裂缝和气泡,否则影响分离效果。氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的 3/4 ,装好柱后柱上面覆一层滤纸,以保持柱上端顶部平整若顶部不平,将产生不规则的色带。
溶媒中丙酮可增强洗脱效果,但含量不宜过多,以免洗脱过快使色带分离不清晰。
4 .分离过程中,要连续不断地加入洗脱剂,并保持一定高度的液面,在整个操作过程中应注意不使氧化铝表面地溶液流干。
5 . SbCl3 腐蚀性较强,使用过程中勿接触皮肤。 SbCl3 遇水生成碱式盐 [Sb(OH)2Cl]] 再变成氯氧化锑 (SbOCl) ,此化合物与胡萝卜素不发生作用,可出现混浊。
六、思考题
1 .吸附层析法的基本原理是什么?
2 .为使胡萝卜素的分离效果更佳,操作中应注意什么?
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