优良菌种的选育课件.ppt

四 原生质体融合技术在微生物育种中应用 由于目前应用于生产的菌种，大多数是经过反复诱变处理获得的，对许多诱变剂已经不敏感，效果也不明显。采用原生质体融合技术，获得了不少有工业利用价值的菌株。 1、用于选育高产优质菌株 如酿酒酵母可以利用葡萄糖产生酒精，但不能利用淀粉和湖精，糖化酵母能利用淀粉和糊精，将这两个菌株进行原生质体融合，可得到利用淀粉和糊精直接产生酒精的融合子。 将产蛋白酶对噬菌体敏感的菌株与抗噬菌体菌株进行融合，获得了抗噬菌体的高产地蛋白酶菌株。 2、产生新的产物 有效的种间原生体融合，有可能发生不同菌种的调节基因和结构基因的重组，诱发原处于抑制状态的沉默基因的表达。特别是在抗生素产生菌中可以产生新的杂种抗生素。 例如庆大霉素产生菌庆丰链霉菌和井岗霉素产生菌的原生质体种间融合，得到的重组子中有的产生聚醚类抗生素，有的产生环状多肽类新的抗生素。 第四节 基因工程育种 基因体外重组育种： 是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达， 完整的基因克隆过程包括以下步骤 １、获得待克隆的DNA片段（目的基确 因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。 一、目的基因的获取 1、通过建立基因文库分离靶基因 2、化学合成法制备DNA片段 3、聚合酶链反应法扩增基因片段 1、通过建立基因文库分离靶基因 基因文库包括两类： 基因组文库 应用DNA重组技术，可以很容易地将各种生物体的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的重组体中，以备需要时应用。 cDNA文库 用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表达的内含子。 2、化学合成法制备DNA片段 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因 存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 提高菌株产量的潜力较大。 二、原生质体融合原理和育种步骤 两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶，去除细胞壁后，在促溶剂诱导下，两个裸露的原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步融合，形成杂合二倍体或杂合系，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组目的。 原生质体融合育种步骤 1．亲本选择 2. 标记菌株的筛选和稳定性验证。 3．原生质体制备。 4．原生质融合。 5．融合体再生。 6．融合体检出。 7．生产性能筛选。 三、原生质体融合育种的要点 （一）亲本选择 生产用菌 诱变过程中的某些符合要求的菌株， 自然分离的野生型菌株。 直接亲本。 所谓直接亲本是将具有遗传标记的菌株直接用于融合杂交配对，它是由原始亲本菌株经诱变剂处理后具有营养缺陷型标记、抗性标记或其他遗传标记的菌株。如果不采用缺陷型和抗性标记，而具有其他遗传标记的也可以将原始亲本直接进行融合育种。 (二)遗传标记 1、营养缺陷型标记 2、抗性标记 3、灭活标记 4、温度敏感性标记 5、荧光染色标记 1、营养缺陷型标记 这是原生质体融合育种中经常使用的方法。通过人工诱变使双亲本分别带上不同的营养缺陷型标记，融合后于基本培养基上培养，其中未融合的两亲本由于不能合成某种营养因子而无法再生，只有经融合的后代因遗传物质互补而能够在基本培养基上生长。营养缺陷型标记 可选择单缺、双缺或多缺，为了避免回复突变干扰，常常选用双营养缺陷型标记。 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。 2、抗性标记 选择具有不同抗性的亲本融合，利用菌株的抗性差异选择重组体。抗性标记有抗逆性（如高温、高盐、高pH）和抗药性等，其中抗药性常用。 不同微生物对某一药物的抗性程度不一，这是由遗传物质决定的。利用这种差异能在相应药物的选择性培养基上获得重组体。有时也把抗性标记与营养缺陷型标记结合使用，能提高育种效率和消除不利影响。 3、灭活标记 把预融合的双亲中任何一方的原生质体通过热、紫外线或药物灭活，使细胞内的某些酶和代谢途径钝化，造成细胞不能合成某些营养，当和另一方具有正常活性的原生质体融合后所得到的重组体可在基本营养培养基上生长。这样一来可以省去营养缺陷型标记。 4、温度敏感性标记 在选育耐盐酵母时，有人用耐高温而不耐高渗的酿酒酵母UCD522和