《生物化学技术1生命大分子物质的制备》课件.ppt

四、透 析 法 将装有抽提液的透吸袋（半透膜袋）埋于PEG或甘油中，利用其强亲水性吸干抽提液中的水分 五、减压蒸馏法 在减压（真空）状态下进行蒸馏。当真空度较高时，溶液沸点可控制在较低温度（如30℃以下） 适合于常温（30℃）较稳定的物质的浓缩 六、冰冻干燥法 原理：利用低温真空升华原理；即是将冰冻的抽提液置抽真空的干燥器中（如P2O5、硅胶等），水从固态升华为气态并被干燥剂吸附，使抽提液浓缩 第六节 纯化方案的设计与评价 纯化方案的定义 指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法（如沉淀、离子交换、凝胶过滤等）有机地互补联合形成的纯化工艺流程 一、纯化方案的设计 1、选择分离方法： 一般从抽提液中有效成分和杂质之间理 化性质的差异性考虑的 2、纯化方案中各分离方法的排布原则 一般应当先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序+ 处理的方法，而精确、费时和需样品量少的方法，则适宜后选用 选择依据 沉淀法 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 电泳 从粗到精，从简到繁 二、纯化方案的评价 评价方法：对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测 定 ，并将各自的比活力(活力单位数／毫克蛋白)、纯化倍数(每步的比活力／粗抽提液的比活力) 和收得率( 100%)计算出来。视纯化倍数的大小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值 一般认为：凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的；反之，则应用价值不大 在实践中对纯化倍数和收得率的要求，要根据材料来源的难易而变化：若材料来源困难，则希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数 以从赛氏杆菌(Serratia sp．)提取L-门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率的关系 第七节 有效成分纯度和性质的分析 鉴定生物制品纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析、薄膜层析等 定性定量方法：光谱法、色谱法等 分子量测定方法：凝胶过滤、电泳法等 测定了纯度、定性、定量的纯化制品，即可按成本的高低和用量的多少分别分装并保存于4℃或-20℃备用 谢谢使用！ * 掌握材料的选择与处理及确立测定方法* 掌握细胞的破碎、抽提、浓缩 熟悉纯化方案的设计与评价 * 几种测定蛋白质和核酸含量的方法 * 几种蛋白酶的抑制剂 * （二）电化学法 用pH计或酸碱滴定进行测定 （三）生物活性检测法 根据生命活性物质用于实验动物身上引起的变化对生命活性物质进行检测 如：HCG能使小鼠子宫加速增殖，故通过注入HCG后检测小鼠子宫的变化来推测HCG 的生物活性 （四）免疫分析法 利用Ag-Ab特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质灵敏定性或定量 如：酶联免疫吸附法 （五）生物传感器 利用生物传感器的 敏感膜与待测液中某一成分进行反应，来显示有效成分的数量 几种测定蛋白质和核酸含量的方法 第三节 细胞的破碎 有效成分有的存在于“材料”细胞外，有的存在于细胞内。就原核细胞而言，若有效成分分泌到细胞外（如淀粉酶类、水解酶类），则分离培养液上清，用相应试剂和方法即可提取制备；若有效成分存在于细胞内（如氧化还原酶类），则需破碎细胞，再进行提取 但也有例外，如从铜绿假单胞菌中提取ALP时，可不破细胞，用0.2mol/LMgCl2的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.4）或0.2mol/LMgCl2的溶液（pH8.4）进行抽提（提取酶蛋白后的细菌细胞，可继续培养） 一般动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破碎，往往在组织绞碎或提取时就破坏了，而植物和微生物的细胞壁较牢固，需提前进行专门的破细胞操作 常用方法 机械破碎（研磨法、组织器捣碎法、超声波法、压榨法和冻融法） 溶胀和自溶 化学处理 生物酶降解 一、机械破碎 1.研磨法：将剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研 磨。为提高研磨效率，也可加入一定量的石 英砂（注意“吸附”）。大规模生产时，可 用电动研磨法（如球磨机） 此法为温和破碎，适用于动物细胞和细菌细胞的破碎 2.组织捣碎器法：捣碎器（8000~10000r/min）处理30~45S, 植物和动物细胞可完全破碎，但对微生物需加石英砂才有效；注意必须低温捣碎，以防温度升高引起有效成分变性，因此时间不宜过长——剧烈方法 3.超声波法：利用超声波破碎细胞壁和细胞器的有效方法，时间一般较长，（5~10min或更长。为防止电器长时间运