《生物化学实验8聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳》课件.ppt

实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质 一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术 二、原理 电泳：带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。 氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。 不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。 泳动度（或迁移率）首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。 泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响。 影响泳动速度的主要外界因素有溶液的粘度、电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象 表 电泳技术的种类 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 不连续体系由电