《生物技术制药第六章植物细胞制药》课件.ppt

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二、工艺过程 1.西洋参细胞种质选择与处理 取人工栽培的西洋参根,弃去所有病变、受伤及形态不规则的个体,用小刷子于流动的自来水下充分洗刷,除去根表面上所有尘粒和污物,然后将其切成50-100mm厚的片段,浸入70%乙醇中30秒,取出浸于5%安替福民(含有效氯5.25%的氯化钠溶液)、10%漂白粉或0.1%升汞溶液中10-20分,取出后用无菌水充分洗去消毒剂,备用。 2.愈伤组织的诱导 诱导西洋参愈伤组织的培养基为添加2.5mg/L 2,4-D、0.8mg/LKT及0.7g/L酪蛋白水解物的MS培养基。50mL三角瓶装量为20mL,琼脂浓度为0.8%,灭菌后备用。然后取已消毒的西洋参根的片段,切成1mm厚,4-5mm见方的立方小块组织,再向每个培养瓶中接1g左右的小组织块,于25-26度培养20天后即长成愈伤组织。采用同样培养基进行移植继代培养,移植过程每瓶均用同一块愈伤组织切割分散和接种培养。如此往复循环,进行20-30次移植继代培养,即可获得多个西洋参愈伤组织无性系。 3.西洋参细胞悬浮培养 培养基为添加1.25mg/L 2,4-D、0.4mg/L KT及0.7g/L酪蛋白水解物的MS培养基。500毫升三角瓶装量为100毫升,酸度为5.8,在99-100KP压力下灭菌15-20分,冷却至室温备用。然后,在无菌操作条件下用50毫升培养基将每瓶西洋参愈伤组织无性系洗下并通过筛网流入无菌量筒中,沉淀10-15分,倾去上清夜,下层细胞倾入含100毫升培养基的500毫升培养瓶中,接种量为1-2克/升细胞干重然后至摇床中,于27-29度,以120转/分速度振荡,振幅为2.5 厘米,培养20-25天后即得西洋参细胞悬浮培养物 4.西洋参大量培养 培养基与细胞悬浮培养相同,反应器为10升通气搅拌罐,培养基充满系数为0.7-0.8,将上述悬浮细胞培养物直接接种至搅拌罐反应器中,细胞接种量为1-2克/升干重,在27-29度下,以50-70转/分搅拌速度及0.6-0.8立方米/立方米*分通气速度培养18-20天,即得西洋参细胞培养物 5.细胞收获与干燥 细胞大量培养结束后,用过滤或离心方法收集细胞,用去离子水洗涤3-5次,每次抽干,然后于50度以下真空干燥或冻干,即得培养的西洋参细胞干粉,收率为3-5克/升干重 第七节 进展和展望 20世纪90年代以来,对于植物细胞及其代谢产物的研究进入了新的发展时期,并出现了很多新技术和新方法,比如诱导子、前体饲养、两相培养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等,显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景 概 况 一、诱导子 在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量,并可促进产物分泌到培养基中 二、前体饲养 是增加次级代谢产物产率的重要方法,次级代谢产物的合成依赖于3中主要原材料的供应 ①莽草酸:属于芳香化合物。是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的 前体 ②氨基酸:形成生物碱及肽类抗生素(包括青霉素类和头孢菌素类) ③乙酸:是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素,多酚类,类异戊二烯等的前体 如 在东北红豆杉细胞培养中发现,在培养基中加入0.1mol/L苯时,紫杉醇产量会增加一倍 三、两相培养法 基本宗旨:在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元 该法通过加入固相或疏水液相,形成两相培养体系,从而达到收集分泌产物的目的 优点:可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用,并可保护产物免受培养基中 催化酶或酸对产物的影响;并可简化下游处理过程,降低生产成本 两相培养系统需满足下列条件: ①添加的固相(如树脂等)或液相对细胞无毒害作用,不影响细胞生长和 产物合成 ②产物易被固相吸附或被有机相溶解 ③两相易分离 ④如为固相不吸附培养基中的添加成分(植物生长调节剂或有机成分) 四、毛状根和冠瘿瘤培养 当植物被特殊病原菌(如农杆菌)感染后,农杆菌能将质粒中的一段转移DNA(T-DNA)片段整合到植物细胞核的DNA基因编码上,作为表现型,从被感染处生长出冠瘿瘤或毛状根,可用于生产有用的化合物 1.毛状根培养 利用发根农杆菌的转化作用进行次级代谢产物的生产,极具发展前途,其生长快速和次级代谢产物含量高,特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。 特点:①激素自养;②次级代谢产物含量高且稳定;③增殖速度快 2.冠瘿组织培养 有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎轴中合成,利用冠瘿组织培养易于得到这些物质,冠瘿组织的获得,是由根瘤农杆菌感染植物组织,质粒转化后获得冠瘿瘤,经过除菌后,从冠瘿瘤培养获得的 特点:激素自养、增殖速度快 3.转基因植物和活性成分生产 将外源功能基因导入植物的基因组,并

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