《生物化学技术5离子交换层析1》课件.ppt

胞嘧啶(cytosine, C) 尿嘧啶(uracil, U) 腺嘌呤(adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) 步骤 732阳离子交换树脂用pH1.5的盐酸溶液平衡 单核苷酸溶液用6mol/L盐酸调pH1.5，上柱 用去离子水洗脱，流速约60ml/min，以6L/瓶分级收集洗脱液 用UV法分别测定各瓶含量，绘制洗脱曲线（图5-16） 二、测定蛋白质的等电点 1.特点 根据蛋白质与交换剂之间的结合力受pH影响的原理，本法具有快速、准确和重复性好的优点 2.步骤 取400mg左右QAE-Sephadex A-50或SP-Sephadex C-50浸泡在蒸馏水中膨胀，漂洗，抽滤(强性离子交换剂) 精确称取500mg湿胶若干份，分别装入5ml试管中，每管用不同pH缓冲液洗涤，共洗涤5~10次，洗涤液离心（2000r/min），除去上清夜 分别加入1ml样品溶液反应约10min 离心，取上清夜加适量高浓度的缓冲液（ pH 7.0）使各管溶液pH一致，然后测定各管的A280或活力单位 以A280为纵坐标，pH为横坐标作图（图5-19），用标准物测出的截距b和斜率m，测定出未知样品的最高吸光度所对应的pH值（YH）和最低吸光度值所对应的pH值（YL） 则 有时为了简便，仅取 谢谢使用！ （四）交换容量 1.定义：指离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物进行 交换的能力 2.表示方法 总交换容量：只与离子交换剂本身有关 有效交换容量：除与离子交换剂本身的性质有关外，还与测定条件有关 3.影响交换容量的因素 （1）筛孔 有效交换容量与交换剂筛孔的直径及分离物的分子量大小密切相关 当离子交换剂的交联度较低时，用前先进行充分溶胀时，其筛孔会增大，结果使大分子物质能进入筛孔与电荷基团交换，而且使交换剂的电荷基团暴露出来；从而增加有效交换容量 如表5-7：DEAE-Sephadex A-25和DEAE-Sephadex A-50对不同分子量的蛋白质的束缚容量 （2）离子强度 当溶液中的离子强度升高时，可降低交换剂的有效交换容量（因为高强度的离子含量会竞争离子交换剂上的束缚位点） ————这也是用高离子强度的缓冲液作为洗脱剂洗脱被束缚在交换剂上的有效成分的依据 （3）pH值 对于强离子交换剂而言，在任何pH环境中都处于解离状态，所以交换容量与pH的变化基本无关 但对于弱离子交换剂而言，其交换容量与溶液的pH密切相关（因为弱离子交换剂的电离程度会受到溶液pH 的影响，从而影响电荷基团的数量） 弱阴离子交换剂的交换容量随着pH值（＜其pK值）的下降而增大；弱阳离子交换剂的交换容量随着溶液pH值（＞其pK值）的上升而增大 4.交换容量的测定 （1）强酸型阳离子交换剂：测定前，先用一定量酸液使交换剂转变成H型（即可交换离子为H+），然后用蒸馏水洗至中性；用5%NaCl溶液通过交换剂，直至流出液为中性。再用D.W洗净，合并流出液，以标准NaOH溶液滴定至甲基红终点。由交换剂所消耗的碱量计算总交换容量 （2）中强或弱酸性阳离子交换剂：先将交换剂转变成“H型”，接着将一定量体积的标准液通过适量的H型交换剂后，D.W洗净，合并流出液，以标准酸溶液滴定至甲基红终点（ 回滴过量的NaOH ），由交换剂所消耗的碱量计算总交换容量 （3）强碱型阴离子交换剂：先将一定量的强碱型阴离子交换剂转换成-OH型，D.W洗至中性后，用5%NaCl通过交换剂直至流出液为中性，D.W洗净，合并流出液。以标准酸液滴定至甲基红终点。由交换剂所消耗的酸量计算总交换容量 （4）弱碱型阴离子交换剂：其测定方法同“强碱型阴离子交换剂” （五）稳定性 基质不同，离子交换剂的稳定性有差异 树脂类离子交换剂在较强的酸性或碱性环境条件下短时间处理仍然稳定 水溶性离子交换剂在水、盐、弱酸、弱碱和有机溶剂环境中稳定，但在强酸、强碱、氧化剂和多糖水解酶环境中不稳定；有时还需低温加抑菌剂（如NaN3）保存。如交联纤维素在强碱性环境下其大分子结构易破坏；琼脂糖凝胶存放不当易染菌等 （六）比 重 离子交换剂的比重随溶胀溶剂的不同而不同。所以，交换剂经D.W溶胀，酸、碱处理后，装柱之前需用平衡液充分平衡，以免装柱时出现“上浮”现象 （七）流 速 通常用ml/h或ml/cm2.h表示。离子交换层析的流速一般由交换剂的性质、操作压、层析柱体积和被分离样品的要求等因素决定。在操作压和其它层析条件相同的情况下： 交换剂的颗粒大，流速就快 洗脱液的黏度大，流速就慢 树脂、琼脂糖和高交联度的葡聚糖等离子交换剂（机械强度