《生物显微技术第二章切片的制作》课件.ppt

石蜡切片的制作 石蜡切片的过程 动物的处死 动物组织取材 固定 组织固定后的处理 脱水和透明 包埋 切片 一、动物的处死 麻醉 空气栓塞 颈椎脱臼或断头 股动脉放血 二、动物组织取材 动物组织取材原则： 尽量保持组织的生活状态。 动作要快 不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。 三、固定 1、目的： 尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。 保持细胞和组织原有的形态结构， 保持组织内部成分特征不发生变化。 2、方式：浸入式 灌注式 灌注式 此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。 灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。 3、固定液 醛类固定剂　 非醛类固定剂 丙酮及醇类固定剂 醛类固定剂 双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。 包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛 通常与其他的试剂联合使用 优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。 缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。 非醛类固定剂 氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂 重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。 苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂， 醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。 蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。 四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与 电镜观察切片的固定与染色。 丙酮及醇类固定剂 丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。 乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。 混合固定剂 固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4 成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中， 1倍的磷酸缓冲液:PBS MV NaCl 140mM 58.44 KCl 2.7mM 74.55 NaH2PO4?12H2O， 10mM 358.14 KH2PO4 1.8mM 136.09 调pH至7.4。 Bouin’s液 苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原 37%-40%福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪 冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质 固定组织时应注意： ①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 ②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。 ③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。 固定时间的选择 不同的研究目的所需使用的固定液。 材料的大小，组织的特性与致密度。 温度的不同有所差别。 组织固定后的处理 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 修块:大小合适、去除形态不好的部分， 四、脱水 脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。 脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等 乙醇：最常用的脱水剂 一般组织：70%---80%----90%--100%--- 100% 特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%--- 80%---90%--100%--- 100% 每步30分钟左右。 要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间 不能过度脱水（使组织变脆） 不同组织脱水时间不同： 大的致密的组织需要延长脱水时间 为加速各级酒精的穿透力，脱水可 在37℃温箱中进行。 五、透明或媒浸 目的与作用 对组织的最后脱水处理 与包埋剂置换 透明剂： 苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂 100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。 六、包埋 包埋剂的特点： 具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。 能完全进入组织。