3,5-二消基水杨酸(DNS)法测定还原糖.docVIP

3,5-二硝基水杨酸比色法 ----标准曲线的制作 1.实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 2.实验材料、主要仪器和试剂 2.1实验材料 主要用到这些实验材料：红曲黄色素发酵液、钠虑膜浓缩后红曲黄色素液、旋转蒸发后红曲黄色素液。 2.2主要仪器 本实验用到的实验仪器有： 具塞玻璃刻度比色管：25mL×19； 烧杯：100mL×4； 三角瓶：100mL×1； 容量瓶：100mL×3，50mL×3； 刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1； 沸水浴； 冰浴； 扭力天平； UV—2802SH型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2.3实验试剂 1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 3．实验步骤 制作葡萄糖标准曲线 取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL葡萄糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 ? 2 0.4 1.6 1.5 0.4 ? 3 0.6 1.4 1.5 0.6 ? 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 ? 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。 蒽酮比色法测糖 一　目的　掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法 二　原理　蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。　 三　实验器材及试剂 马铃薯干粉 可调试移液器或移液管 可见分光光度计（723型） 电子分析天平 水浴锅 电炉子 蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。 标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。 四、操作 1.制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。 表1?蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作 ?沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色 ? 葡萄糖浓度（mg/ml） 2.样品含量的测定　　　 样品液的制作： 精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出， 3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形 瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中 样品液的测定： （1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却） 表2?蒽酮比色法定糖——样品的测定 （2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。 （3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查