SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理.docVIP

SDS电泳原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。 SDS电泳胶配制： 分离胶（12%） 4ml 8ml 10ml H2O 1.32ml 2.64 ml 3.3ml Acr/Bis(30% ) 1.6ml 3.2 ml 4.0ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.0ml 2.0ml 2.5ml SDS(30%) 40μl 80μl 100μl AP(10%) 40μl 80μl 100μl TEMED 1.6μl 3.2μl 100μl 水封30分钟 浓缩胶（5%） 2 ml 4 ml 5 ml H2O 1.36 ml 2.72 ml 3.4 ml Acr/Bis(30% ) 0.33ml 0.66 ml 0.83ml 1.0M Tris-HCl(pH6.8) 0.25 ml 0.5 ml 6.3ml SDS(30%) 20μl 40μl 50μl AP(10%) 20μl 40μl 50μl TEMED 2.0μl 4.0μl 5.0μl SDS试剂配制： 试剂名称 配制方法 备注 30% Acr/Bis 29%（w/v）丙烯酰胺、1%（w/v）N,N-亚甲双丙烯酰胺、一般配置100ml，称重Acr 29g，Bis 1g，加温热的去离子水100ml，溶解 室温，藏于棕色瓶子，几个月需要重新配制。具有强神经毒性，易吸附于皮肤，配置是应带面具和手套。 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.5M/L,一般配置100ml，称重23.6g，加去离子水100毫升，溶解 须用Ttis碱，用HCl调节pH 1.0M Tris-HCl(pH6.8) 1.0M/L,一般配置100ml，称重15.8g，加去离子水100毫升，溶解 须用Ttis碱，用HCl调节pH 10% S