微量克氏定氮法量测定蛋白质含量.ppt

微量克氏定氮法测定蛋白质含量 一、实验目的 掌握微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量的原理和操作技术。 二、实验原理 天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 ??? 整个反应过程可分为消化、蒸馏及滴定三大步骤。 ??? 样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称之为“消化”。 但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下： CH3NH2COOH + 3H2SO4 → 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 （1） 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4????????????????????????????? ????????? （2） (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 ????????????? （3） ??? 反应（1）、（2）在克氏定氮烧瓶中完成。反应（3）在克氏定氮仪内进行。 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。 三、实验器材 1．微量克氏定氮仪：参见图5-1，1套/组。 2．克氏定氮烧瓶：2只/组。 3．取样器：，5mL、1 mL各1只/组。 使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL）→用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。 4．电炉：公用。 5．1．微量滴定管（5 mL）：1只/2组。 6．酒精灯：1只/组。 7．锥形瓶（100 mL）：4只/组。 8．铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量筒等。 五、实验操作 ①.消化：将两个50mL的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液（卵清蛋白液）。然后用取样器各加浓硫酸2mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约20mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，参见图5-3，注意先启动抽风机。消化时间为2～4h。在消化时可以同时进行第二步。 消化装置 ②.蒸馏：取100mL锥形瓶3只，洗涤干净，用取样器各加入2%硼酸溶液5.0mL，加入几滴指示剂，溶液显紫色，用 表面皿盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。 安装好微量克氏定氮仪。微量克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置，，注意保证每个夹子夹紧而不漏气，保证加样口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮仪上（这可以通过调整其下方夹子的方位来实现）。 a)蒸馏瓶的洗涤 ? 参见图5-6，将自来水由5经7注入到蒸馏瓶夹层2（即蒸汽发生室）中，使水面达到蒸馏瓶颈部的转弯处。把装有蒸馏水的锥形瓶9置于冷凝器4下方，并将冷凝器下方的导管12下端插入锥形瓶液面以下，再将少量蒸馏水由漏斗3注入到蒸馏瓶的反应室1中，把所有夹子夹紧，打开冷凝水。用酒精灯11将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸，然后移去火源，锥形瓶9中的蒸馏水就会从冷凝器下方的导管 12倒流到蒸馏瓶的反应室1内，再倒流至蒸馏瓶的夹层2中，由废液排出口8排出。按照上述方法将仪器洗涤2～3次。最后，反应室1中的余液可以按下法清空：把所有夹子夹紧，将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸，先移去锥形瓶9，然后移去火源，反应室1中余液将倒流至夹层2中，由7排出。以后每次在做下一次蒸馏之前都要先将蒸馏瓶洗涤2～3次，并将反应室1清空。 b)空白和样品的蒸馏 把装有5.0mL的2%硼酸溶液的锥形瓶9置于冷凝器的下方，将冷凝器下方的导管12下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。先将克氏烧瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗3注入到蒸馏瓶的反