14 第17章 流式细胞仪分析技术及应用.ppt

PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻红蛋白 能量传递复合染料机制 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直接标记:干扰少,但需购买多种单抗。 间接标记:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体。 组合标记： （二）免疫荧光标记 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待测标本，在悬液中微球与待检物质特异性结合，加入荧光标记的报告分子或特异性抗体，经激光照射后不同待测物产生不同颜色（定性），并通过测定微球上的荧光强度对被测物的量进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用 微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码） 通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析。 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度25~37℃，pH7.0~7.2 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂 （二）免疫荧光染色的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-check Flow-set Flow-count （三）仪器操作的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：采用的质控物Immuno-Trol Cells 是全血质控品，与待测标本一起标记和检测，结果达标定靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 第四节 在免疫学检验中的应用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关。 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体。 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 一、淋巴细胞及其亚群的分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型。 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变。 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者。 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 七、移植免疫中的应用 小 结 流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。 思考题 流式细胞仪的分析检测原理是什么？ 流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？ 细胞分选的基本原理。 FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？ 如何进行FCM分析检测样品的制备？ 流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？ 流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？ 流式细胞术有哪些临床应用价值？ 流式细胞仪分析中常见的荧