IPS操作-慢病毒-汉恒生物.PDF

IPS 操作指南-慢病毒 IPS 操作指南-慢病毒 IPS 简介： iPS 细胞是通过基因转染技术 （gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使， 体细胞直接重构成为胚胎干细胞 （embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。现在大多是通过 病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。2006 年日本京都大学 Shinya Yamanaka 在世界著名学术杂志 《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把 Oct3/4,Sox2、c-Myc 和 Klf4 这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产 生的 iPS 细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能 力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。 现分别介绍一下小鼠的和人的 iPS 的诱导步骤。 一、实验材料 TM 慢病毒包装体系 （来自汉恒生物，Hanbio ）： 慢病毒表达质粒 plvx-OCT4、plvx -SOX2、plvx -KLF4 和 plvx-c-MYC （来自汉恒生物， TM Hanbio ）； TM 辅助质粒 PSPAX2 和 PMD2 （来自汉恒生物，Hanbio ）； TM 病毒包装细胞：293T 细胞 （来自汉恒生物，Hanbio ）； TM ES Feeder 细胞：MEF （C57）（来自汉恒生物，Hanbio ） 。 二、实验仪器和耗材 （一）实验仪器 二级安全柜、37 度培养箱、4 度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。 （二）实验耗材 PBS、无菌水、明胶粉、DMEM 培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物 （SR）、 mTESR1、T75 培养瓶、无菌水、15ml 离心管、50ml 离心管，巴氏管等。 - 116 - 汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065 地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号景泰大厦 1503 021 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器 1 号楼 314 汉恒生物科技 邮箱：service@ IPS 操作指南-慢病毒 三、ips 诱导方法 （一）Feeder 细胞 1、Feeder 细胞的分离 （MEF） 取妊娠 13.5-14.5d 的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用 PBS 进行冲洗。 2 将胎体剪碎成小于 1mm 的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入 0.25%胰酶-0.04%EDTA 2~3ml 浸泡组织块，常温消化 2~3min。 轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的 10%FBS DMEM 终止消化，通过 100 目滤网过滤后，将 获得的液体离心，1000rpm，5min。 弃上清，加入培养基重悬细胞