2009级硕士高级免疫学试验技术.PPT

吉林大学基础医学院免疫学教研室 吉林大学基础医学院免疫学教研室 高级免疫学实验技术 2012级硕士研究生 吉林大学白求恩医学院 免疫学系 袁红艳 淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) 原理 检测方法 操作步骤 应用 实验分组及材料 器材 酒精棉球 若干 无菌纱布块 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）4盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 4套/room 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 4套/room 细胞培养箱（37℃ ，5%CO2) 酶标仪 离心机 2个/room 超净台 2个/room 动物及试剂 小鼠 1只/组 RPMI1640(5%NCS) 100ml/room ConA（2.5,5,10μg/ml) 各1.5ml/tube 白细胞计数液（2%冰醋酸）1瓶/room MTT（5mg/ml) 1.5ml/room 二甲亚砜（DMSO) 5ml/组 分组： 每组四人，一只小鼠，其中两人做胸腺，两人做脾脏 实验步骤 单细胞悬液的制备： 颈椎脱臼法处死小鼠，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 于超净台内取出脾脏和胸腺(各1/2)，分别放入预先盛有2ml RPMI1640(5%NCS)培养液的平皿内。 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000μl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5ml EP管中。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20μl，加到盛有980μl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。 调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。 细胞计数板 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50) 4 细胞培养： 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱中，培养48小时。 MTT掺入： 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10μl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。 在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时。 然后小心吸弃上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 加入100μl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录结果。 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值 原理 Lymphocytes(B/T) Mitogens Specificity Ag Proliferation Transformation Lymphoblast Nucleic Acid↑ Protein ↑ 常用的丝裂原 T cell proliferation 植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA) (人T） 刀豆素A（concanavalin, Con A）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) B cell proliferation 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) 返回 检测方法 形态学方法 3H-TdR掺入法 MTT法 (本次实验采用) 返回 形态学方法 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3-4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率： 返回 3H-TdR掺入法 G0 G1 有丝分裂原 特异性抗原 S Pr,RNA,DNA 前体物质 DNA↑↑ New DNA 3H-TdR TdR 3H-TdR cpm 返回 MTT法 活/增殖 期的细胞 线粒体 能量代谢 琥珀酸脱氢酶 MTT MTT掺入 还 原 甲臜颗粒 formazan 细胞内/周围 溶解 测OD值 返回 操作步骤 1W 无菌取