沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞生长及其趋-第三军医大学学报.PDF

３４ 　　　　　　　　　　　　　　第三军医大学学报，２０１７，３９（１）　　 　　　　　　ｈｔｔｐ：／／ａａｍｍｔ．ｔｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　 ＤＯＩ：１０．１６０１６／ｊ．１０００５４０４．２０１６０７１２９ 沉默ＣＸ３ＣＬ１基因对骨髓间充质干细胞生长及其趋化效应的影响 郝　磊，田　洪，牟长河，张玉波，周虎传，宋　川，刘　磊　　（４０００２０重庆，解放军第３２４医院脑血管病中心） 　　［摘要］　目的　构建大鼠趋化因子ＣＸ３Ｃ的配体 １（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅＣＸ３Ｃｌｉｇａｎｄ１，ＣＸ３ＣＬ１）基因慢病 毒ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）载体，观测其沉默 ＣＸ３ＣＬ１基因对骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｂＭＳＣｓ）生长及其趋化效应的影响。方法　首先分离、培养大鼠 骨髓ｂＭＳＣｓ，并予以流式细胞术检测鉴定。针对ＣＸ３ＣＬ１基因ｍＲＮＡ序列，筛选３个小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）靶点并予以合成。把合成的ｓｉＲＮＡ导入ｂＭＳＣｓ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测其对靶基因编 码蛋白的抑制效应，以此明确最佳 ｓｉＲＮＡ。设计与合成针对最佳 ｓｉＲＮＡ序列的短发夹 ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ），连入ＣＤ５１３Ｂ１慢病毒载体，构建ＣＤ５１３Ｂ１／ＣＸ３ＣＬ１ｓｈＲＮＡ慢病毒，并行测序鉴定。测 序正确者用２９３Ｔ细胞包装成具有高效感染力的ＣＤ５１３Ｂ１／ＣＸ３ＣＬ１ｓｈＲＮＡ重组慢病毒，该重组病毒用 于感染ｂＭＳＣｓ。分离培养大鼠脾巨噬细胞，将其与被感染的ｂＭＳＣｓ共培养。倒置显微镜下观测被感染 ｂＭＳＣｓ的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达情况；ＣＣＫ８检测被感染ｂＭＳＣｓ的生长变化；ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测 被感染ｂＭＳＣｓ的ＣＸ３ＣＬ１与核抗原ＰＣＮＡ基因的表达变化；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测被感染ｂＭＳＣｓ的ＣＸ３ＣＬ１ 和ＰＣＮＡ蛋白，与被感染的ｂＭＳＣｓ共培养的脾巨噬细胞的趋化因子ＭＣＳＦ和ＩＬ８的表达变化。结果　 大鼠ｂＭＳＣｓ得以分离、培养和鉴定。筛检得ＣＸ３ＣＬ１基因的最佳干扰序列：ＣＴＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡ； 测序证实，成功构建重组慢病毒载体ＣＤ５１３Ｂ１／ＣＸ３ＣＬ１ｓｈＲＮＡ。荧光观察表明，被ＣＤ５１３Ｂ１／ＣＸ３ＣＬ１ ｓｈＲＮＡ病毒感染的ｂＭＳＣｓ明显表达 ＧＦＰ。ＣＣＫ８检测结果显示，与对照细胞比较，沉默 ＣＸ３ＣＬ１的 ｂＭＳＣｓ的生长减慢，４８ｈ开始更为明显（Ｐ＜０．０１）；ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＣＸ３ＣＬ１ 基因的ｓｈＲＮＡ慢病毒能有效沉默ｂＭＳＣｓ的ＣＸ３ＣＬ１，并下调其核抗原基因ＰＣＮＡ及其蛋白的表达，沉默 ＣＸ３ＣＬ１的ｂＭＳＣｓ能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子ＭＣＳＦ、ＩＬ８的表达。结论　成功构建 ＣＸ３ＣＬ１基因ＲＮＡｉ重组慢病毒载体。该病毒载体能有效沉默ｂＭＳＣｓ的ＣＸ３ＣＬ１基因，使ｂＭＳＣｓ的生 长减慢并下调其核抗原ＰＣＮＡ基因及其编码蛋白的表达。沉默ＣＸ３ＣＬ１的ｂＭＳＣｓ能下调与其共培养的 脾巨噬细胞的趋化因子ＭＣＳＦ、ＩＬ８的表达。 　　［关键词］　 趋化因子ＣＸ３Ｃ的配体１基因；短发夹ＲＮＡ；骨髓间充质干细胞；慢病毒；趋化效应 　　［中图法分类号］　Ｒ３２９．２；Ｒ３９４３３；Ｒ３９４．２ ［文献标志码］　Ａ ＥｆｆｅｃｔｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆＣＸ３ＣＬ１ｇｅｎｅｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ ＨａｏＬｅｉ，ＴｉａｎＨｏｎｇ，ＭｏｕＣｈａｎｇｈｅ，ＺｈａｎｇＹｕｂｏ，ＨｏｕＨｕｚｈｕａｎ，ＳｏｎｇＣｈｕａｎ，ＬｉｕＬｅｉ（ＣｅｎｔｅｒｏｆＣｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎｏ．３２４ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０００２０，Ｃｈｉｎａ） 　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｍｅｄｉｃａｔｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｔｃｈｅｍｏｋｉｎｅＣＸ３Ｃｌｉｇａｎｄ１（ＣＸ３ＣＬ１）ａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓ