乳酸茵基因敲除技术的研究进展-食品与发酵工业.PDF

DOI：10．13995／j．cnki．11一1802／ts．201601044 乳酸茵基因敲除技术的研究进展 杜胜阳，王斌斌，冯佳，侯斌晓，乔建军+ (天津大学化工学院制药工程系，系统生物工程教育部重点实验室，天津，300072) 摘 要 乳酸菌是革兰氏阳性菌，广泛用于食品、医药、轻工业及饲料工业等行业。对乳酸茵进行遗传操作是调 节、优化其代谢途径的基础。通过基因敲除技术改造乳酸菌基因组，可以判断基因组中未知基因所编码产物的 功能，有目的、有选择地使乳酸菌生产有益的异源基因产物。基因敲除技术已成为当前乳酸菌分子生物学研究 的热点。文中对几种乳酸茵基因敲除策略研究进展及影响敲除效率的因素进行了综述，分析存在的问题并初步 探讨展望了乳酸菌敲除技术的未来发展趋势。 关键词 基因敲除；乳酸菌；同源重组；单链重组；敲除效率 acid 乳酸菌(1acticbacteria，LAB)是一类能发酵成熟，如高效的Red／ET重组系统。然而基因组简化 碳水化合物且主要产物为乳酸的无芽孢、革兰氏阳性 的研究在乳酸菌中尚不成熟，更高效的基因敲除系统 细菌的通称。目前至少分为18个属，包括乳杆菌属 有待探究。目前，大部分乳酸菌基因敲除技术还是依 (￡8cf06Ⅱc泓Hs)、乳球菌属(如c￡Dcoccus)、链球菌属赖于传统的同源重组双交换方法。本文就近年来乳 酸菌基因敲除技术取得的进展进行综述，并探讨了影 (S￡^印tococcHs)、肠球菌属(En￡erococcHs)、明串珠菌属 (kuconos￡Dc)、双歧杆菌属(B沂d060c灯i“m)等。乳酸响敲除效率的有关因素，旨在为今后的深入研究提供 菌代谢相对简单，具有很好的生物安全性，是公认的 有价值的参考。 as 安全级微生物(generallyrecognizedsafe，GRAs)， 1 乳酸菌基因敲除原理概述 被广泛用于食品、医药、轻工业及饲料工业等行 业‘“。 基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的一 随着分子生物学的发展，基因测序技术的改革， 项重要的分子生物学技术，其原理是利用特定方法使 以及后基因组时代的到来，人们已经完成了对多种乳 目标基因失活或者缺失，对染色体进行定点修饰改 酸菌基因组的测序，从基因水平上更加清楚地认识、 造，从而改变细胞的遗传特性。运用基因敲除技术， 了解它的代谢规律。乳酸菌基因组中含有大量非必 可以改变乳酸菌的代谢流向，阻断不必要次级代谢产 需基因，包括次级代谢产物基因簇、插入序列、冗余序 物的积累，降低发酵成本，大幅度提高目的产物的生 列等。敲除这些非必需基因，可以改造得到最小化基 产水平及纯度。另外，基因敲除技术还可用于乳酸菌 因组的乳酸菌。 基因结构与功能研究”1。 随着合成生物学的发展，微生物基因组简化成为 经典基因敲除技术的理论依据是同源重组。同 研究热点。21。乳酸菌的基因组简化后，能优化其代 源重组依赖于基因同源序列的联会，DNA分子间或 谢网络，减少副产物，提高了对底物和能量的利用效 者分子内交换对等的部分，发生重新组合。根据同源 率，提升代谢网络的可控制性以及产物的可预测性。 重组原理，合理设计并通过酶切连接、融合PCR构建 目前，基因组简化的研究在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、 不同结构的重组载体，然后将其导入宿主细胞中，实 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等模式微生物中已相继被报 现对宿主染色体DNA序列的插入、缺失或者置换突 道口’5]。其中，对大肠杆菌基因敲除系统的研究比较 变。乳酸菌中的同源重组是个复杂的过程，通常分为