革胡子鲶抗菌肽hepcidin基因克隆和序列分析.docVIP

革胡子鲶抗菌肽hepcidin基因克隆和序列分析 　　摘要 革胡子鲶生长快、抗病力强，是我国南方重要的水产养殖品种。应用逆转录和套式PCR方法从革胡子鲶（Clarias lazera）肝脏组织RNA中扩增出抗菌肽hepcidin基因cDNA片段，并克隆测序。序列全长233bp，该序列与另外6种淡水和海水鱼类的hepcidin序列进行了比较，序列同源性介于45.7％～76.6％之间，平均值为63.25％，说明克隆得到的hepcidin片断序列是正确的。这为研究革胡子鲶的抗病机理和hepcidin抗菌肽的开发利用提供了基础。 　　关键词 革胡子鲶；hepcidin；基因克隆 　　中图分类号 S965.1281.6 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）11-0265-02 　　 　　革胡子鲶（Clarias lazera）属鲶形目、胡鲶科、胡鲶属，是我国重要的淡水养殖品种之一，目前已在我国南方10多个省市普遍养殖。革胡子鲶病害少，抗病力强，对养殖水体条件要求不高，能在污水环境中长期养殖也不易发病并正常生长，耐低氧，食性独特，喜食其他动物内脏及腐烂的尸体，表现出极强的抗病特性。鱼类抗菌肽与其抗病能力密切相关，而hepcidin是种类繁多的抗菌肽中一种重要的免疫因子。本研究应用RT―PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应）技术得到了革胡子鲶体内的hepcidin基因cDNA片断，并测定其序列，为今后进一步探讨其免疫抗病机理以及通过基因工程方法合成hepcidin开发免疫制剂奠定基础。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　试验鱼：革胡子鲶活鱼购自南宁市五里亭农贸市场。 　　宿主菌和质粒：大肠杆菌E.coli DH5a为广西大学遗传育种实验室保存。克隆质粒pMD18-T Vector购于宝生物（TaKaRa）大连生物工程有限公司。 　　酶和主要试剂：RNA PCR Kit（AMV） Ver 3.0试剂盒，Trizol试剂、质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ均购自宝生物（TaKaRa）大连生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯。 　　引物：由上海鼎安生物科技有限公司合成。 　　1.2方法 　　引物设计：根据GenBank中鲶形目鱼类hepcidin基因的编码序列设计并合成2对特异性引物。外引物：上游F1： 5-AAGAAGCAGCAGAAGAAGGAGAACC和下游F2：5-TTAGAACCTGCAGCAGAACCCAC；内引物：上游F3：5-CGCGTGCGCCGTCATCGTCATC和下游F4：5-TCATT CAGCAGTTGCAGCAGAAT。 　　总RNA的提取：试验鱼运回实验室后处死，迅速从脑颅内取出脑垂体，立即用Trizol试剂提取总RNA，并电泳检测总RNA的完整性。 　　目的基因片断的RT-PCR：按RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0试剂盒说明的方法合成单链cDNA。然后以该单链cDNA为模板进行套式PCR。2次PCR反应条件相同，具体条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；72℃后延伸5min。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。 　　目的基因片断克隆：将PCR产物与pMD18-T载体用T4 DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布含有50mg/L的氨苄青霉素（AMP）LB平板培养。用BamH I、Sal I双酶切法和PCR法筛选鉴定阳性克隆。 　　序列测定：将经过阳性鉴定的菌液送上海鼎安生物科技有限公司进行测序。 　　序列分析：用DNAStar软件包的MegAlign程序进行序列的同源性分析。 　　 　　2结果 　　 　　2.1目的片断RT-PCR扩增和cDNA克隆 　　RT-PCR扩增结果如图1。通过2次PCR，最后得到长度为230bp左右的单一特异性片段。 　　 　　目的片断经与pMD18-T载体连接后，成功转化到大肠杆菌DH5a。阳性克隆的重组子经双酶切鉴定，证明外源片段成功插入载体。此外，重组子经PCR鉴定，证明该质粒是含有外源目的片断的阳性重组子。 　　2.2目的基因片断序列测定 　　测定的革胡子鲶hepcidin片断序列见图2。序列全长233bp。其碱基组成为：A+T占45.49％，C+G占54.51％。 　　2.3同其他鱼类的hepcidin基因序列比较 　　将本研究得到的基因序列与其他6种鱼类的hepcidin基因序列进行碱基的同源性比较，统计得到了不同种类间的遗传