丹参脂溶性成分抑制体外血管新生及机制的研究.docVIP

丹参脂溶性成分抑制体外血管新生及机制的研究 　　[摘要] 该研究利用人脐静脉内皮细胞模型研究丹参脂溶性成分对血管新生的调节作用，并探讨其可能的作用机制。通过建立的细胞模型，确定丹参脂溶性成分对内皮细胞增殖活性和迁移能力的影响；随后利用实时荧光定量PCR技术检测药物作用后血管新生相关细胞因子VEGF-A，VEGF-C和MMP-9的基因表达变化。结果表明，5 mg?L-1的丹参脂溶性成分抑制内皮细胞的增殖和迁移，同时VEGF-A，VEGF-C和MMP-9基因的表达被抑制。表明丹参脂溶性成分可能通过抑制VEGF-A和MMP-9基因的表达来抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而达到抑制血管新生的作用。 　　[关键词] 丹参脂溶性成分；血管新生；人脐静脉内皮细胞；实时荧光定量PCR；血管内皮生长因子 　　血管新生是一个高度复杂、严格调控的生理过程[1]。血管新生在心血管疾病、癌症、糖尿病和肥胖等疾病中发挥着重要作用，目前寻找合适的药物来促进或抑制血管新生已成为治疗这些疾病的主要研究方向。丹参为我国传统中药，主要由脂溶性和水溶性2种成分组成，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效。目前对丹参脂溶性成分调节血管新生的研究大多都是从其单体成分入手，整体研究较少。丹参中的很多单体成分，如丹参酮ⅡA和隐丹参酮能够抑制内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成[2-5]，隐丹参酮和丹参酮ⅡA抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖和血管生成，但其机制并不十分清楚。同时考虑到对于心血管疾病、肿瘤等多因素导致的复杂疾病，中药多组分治疗具有独特优势，因此，本研究从整体出发，研究丹参脂溶性提取物对HUVECs的作用，并考察其对血管新生相关生长因子基因表达的影响，初步探讨其对血管新生的作用机制。 　　1 材料 　　1.1 仪器与试剂 RPMI 1640（Gibco，美国）；胎牛血清（Hyclone，美国）；1000U双抗（Invitrogen，美国）；DMSO（Amresco，美国）；BSA（Sigma，美国）；Trizol Reagent（Invitrogen，美国）；RNase free water（Quagen，美国）；无水乙醇、氯仿、异丙醇（分析纯，北京化工厂）；倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；CO2培养箱（Sanyo，日本）；XP205型电子天平（MettlerToledo，瑞士）；密理博超纯水系统（Millipore，美国）；台式冷冻离心机（Hettich，德国）；Biophotometer核酸紫外分析仪（Eppendorf，德国）。 　　1.2 药物 丹参脂溶性成分本实验室自制（经HPLC进行质量控制）。丹参脂溶性成分的得率为2.4%，主要成分有二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。 　　2 方法与结果 　　2.1 细胞培养 HUVECs以含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基在37 ℃，5% CO2的培养箱中进行培养，待细胞达到80%融合度后对其进行传代，取对数期、生长良好的细胞进行实验。 　　2.2 细胞活性测定 细胞用0.25%的胰酶消化，计数；以5×104个/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后除去培养液，随机分组，分别加入100 μL含不同浓度的丹参脂溶性成分的培养基（药物终浓度为0.5，5，10，20，40，80 mg?L-1，DMSO的最大含量低于0.1%），每组6个复孔，孵育24 h后，MTT（0.5 g?L-1）法测定细胞活性，酶标仪检测波长490 nm，参比波长630 nm测定吸光度。图1为药物作用后细胞活性测定结果，在0～80 mg?L-1，丹参脂溶性成分抑制内皮细胞增殖，并随着浓度的增加，抑制能力逐渐增强。丹参脂溶性成分的半数抑制浓度为38.64 mg?L-1。当丹参脂溶性成分的作用浓度为5 mg?L-1时，对HUVECs增殖活性的抑制率已达到20%以上，因此选择该浓度作为后续考察的作用浓度。 　　2.3 划痕法测定细胞迁移 取计数后的HUVECs单细胞悬液，按5×104个/孔浓度接种于板底划有横线的24孔板中，待细胞达80%融合后，弃去完全培养基，10 μL枪头在每孔中垂直于底部横线划2条直线，PBS清洗，加入含药培养基（5 mg?L-1的丹参脂溶性成分），放入培养箱中培养，分别在0，6，18，24 h时观察拍照。由图2可知，5 mg?L-1的丹参脂溶性成分在6，18，24 h时的迁移趋势相同，药物显著抑制内皮细胞迁移。 　　2.4 Transwell法测定细胞迁移 在Transwell 迁移系统（不含Matrigel基质胶）的上层小室中加入200 μL的含有5×104个细胞的含药培养基（0.1%BSA，无血清），下室中加入500 μL