次级代谢产物生物--合成的调节机制.pptVIP

次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。例如，在利用无细胞体系由青霉素N进行头孢菌素合成时，随着氧分压的增大头孢菌素的合成被促进，同时加入KCN或降低搅拌速度合成量则减少。 4．5 研究微生物药物生物合成 机理的主要方法 微生物药物生物合成机理的研究包括细胞内将一种或几种初级代谢产物转化为次级代谢终产物的反应顺序，以及该反应系统的调节机制。通过了解微生物药物生物合成的机理，可以人为地改变和控制微生物的代谢，大幅度地提高目的产物的产量。 论证生物合成途径的一般步骤为： ①确定构成目的产物的构建单位即生源； ②确定生物合成途径中的关键的中间产物，合理地推断反应顺序； ③分离鉴别生物合成反应中的关键酶。 · 研究方法 喂养实验法或称刺激试验 洗涤菌丝悬浮法 或称静息细胞法 阻断变株法 互补共合成法 同位素标记法 无细胞抽提液法) 酶抑制剂法 遗传特性诱变法 原生质体试验法 去阻遏方法 (1)喂养实验法（或称刺激试验） 在发酵的培养基中，加入某些可能是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的利用情况与促进目的产物生成的效果。这种方法所得出的实验结果是很初步的，难以判断添，例如，所加物质所产生的效果究竟是前体还是刺激作用，需要进一步研究。 (2)洗涤菌丝悬浮法 或称静息细胞法 目的:为了排除原培养基自身的代谢物对不同生长阶段的影响，简化代谢物生物合成的研究系统和区别试验化合物的作用，常借用洗净的静息菌丝体，此时菌体不在分裂过程中，但仍有代谢活力。 试验时取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分和代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物生物合成的影响。为避免菌体内含物的干扰，常把洗净后的菌体悬浮于生理盐水中，保温一定时间，尽可能使其内源营养耗尽，然后再在人工培养系统中进行试验,即饥饿后实验。采用此法，被试验的菌体虽然能以基础原料合成某种代谢物，产量大大减少，但仍可以判断生物合成过程中的一些反应步骤。 (3)阻断变株法(block strains) 将次级代谢产物产生菌进行诱变处理，筛选出失去产生某种目的代谢产物能力的突变株，即生物合成的阻断变株。这种阻断变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物，通过分离、提纯、鉴别中间代谢产物，并与目的代谢产物的化学结构相比较，推断出目的代谢产物的生物合成的反应步骤，然后再分离其反应中的特殊酶类，进一步判断其生化反应的特性。 (4)互补共合成(cosynthesis)法 应用两株生物合成阻断变株，当它们单独培养时均不能产生目的代谢产物，而将它们进行混合培养时获得目的产物或者以后某一步中间体，来证明生物合成所经过的途径，或证明生物合成途径中确实存在某个中间体，通过分别提取、分离和鉴别阻断变株积累的中间体和共合成的产物，了解它们的阻断部位和顺序以及反应过程，推断目的产物的生物合成途径。 以上方法都受到一定的限制，主要是由于菌体细胞膜和细胞壁的通透性对试验化合物的影响。有的试验化合物，虽然确实是产物合成途径中的前体，但因受细胞壁、细胞膜的通透性的障碍或通过时受细胞壁与细胞膜上酶的作用而引起分子降解或发生立体构型的改变等，使这类讨论中得到了负的结果。所以上述方法所得到的负结果并不能否定它不是生物合成中的前体。 (5)同位素标记法 同位素标记法是确定构成目的产物分子“构建元件”的好方法,即应用同位素合成起始物和中间体进行喂养实验。 将具有放射性同位素3H或者14C标记的可疑前体物质加入到次级代谢产物产生菌的培养基中：最佳加入时间是微生物生长阶段的后期，培养结束后，提取分离目的代谢产物，测定结合到次级代谢产物的同位素含量和分布情况，可以判断试验化合物是否参与代谢产物的生物合成。 重要缺点 为了确定同位素的结合位置,还需将产物进行一系列的降解,分离和测定等大量工作. 应用此方法时应注意两点 一是示踪物质虽然是目的产物生物合成的前体物质，但由于不能通过细胞壁进入细胞而不能被结合到产物的分子中，将其错误地认为不是前体物质；二是虽然在目的产物中检测到了示踪物质，但实际是示踪物质在细胞内被降解，真正结合到目的产物分子的是示踪物质的降解产物。 (6)无细胞抽提液法(cell-free extraction) 要进一步证实反应过程还必须依靠有关酶促反应。通常采用无细胞抽提液来进行下一步实验。 制备方法是先用适当的方法（超声波等处理）破碎细胞，释放胞内酶，再经过离心、冷冻干燥，即得到粗酶制品。这种酶制品往往含有多个酶体系，为了排除其他酶对某一种酶反应的干扰，进一步分离纯化制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加入到反应体系，进行酶促反应。检测反应体系中的底物和产物浓度，判断该酶是否催化目的产物的