蛋白质电泳技术介绍.pptVIP

制胶 1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好 2 按照配方制备分离胶，TEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶 3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面） 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟 上样 按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS电泳玻璃板 间隙厚度不同，选择加入样品量。 电泳 打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压 缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。 染色 将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝 ），用摇床摇2－3h 脱色 待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉 ，可以用Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、 估算蛋白浓度。 具体步骤 1. 配胶 2. 装管 每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆 盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂 直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根 玻璃管的容量约为1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm处，用 注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱 顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水 封下的折光面。 3. 装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。 4. 剥胶 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻 轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端 注入H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻 挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极 端为“尾”，若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为正，碱 性端为负。 5. 固定 取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。 6. 测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。 1.样品制备 2.固相预制胶条的水化 3.第一向等电聚焦 3.1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温平衡。 3.2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品。 3.3. 去除预制IPG胶条上的保护层 。 3.4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中 。 3.5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 3.6. 对好正、负极，盖上盖子。 3.7. 设置等电聚焦程序。 4.胶条的平衡 4.1冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 4.2配制胶条平衡缓冲液 I 。 4.3吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 4.4第一次平衡。振荡15分钟。 4.5配制胶条平衡缓冲液 II 。 4.6第二次平衡 ，振荡15分钟。 4.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。 4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。 5.第二向SDS电泳 6.凝胶的染色及检测 7.PDQuest软件分析 8.质谱鉴定 Company Logo LOGO 电泳技术介绍 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE) 基本原理 1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 2.蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理，可解聚成亚基,加入SDS，改变了蛋白质的构象。 3.各种SDS-蛋白质复合物均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原蛋白质，消除了不同蛋白质的荷电差异。 图解 多孔凝胶 混合大分子 电泳 操作流程 制胶 上样 电泳 染色 脱色 具体步骤 等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF) 等电