丹酚酸B大鼠在体鼻循环吸收的研究.docVIP

丹酚酸B大鼠在体鼻循环吸收的研究 　　[摘要]该实验研究了丹酚酸B在大鼠的鼻腔吸收特性，建立了HPLC测定灌流液中丹酚酸B的方法，考察了丹酚酸B的不同pH缓冲液对鼻腔的刺激性以及在鼻灌流液中的稳定性，并系统研究了丹酚酸B在体鼻黏膜吸收特性。采用改良的大鼠在体鼻循环模型，通过测定鼻灌流液中总蛋白和乳酸脱氢酶（LDH）的释放量，定量评价pH4.0，5.0，6.0丹酚酸B磷酸缓冲液对大鼠鼻黏膜的刺激性及其在鼻灌流液中的稳定性，比较低、中、高质量浓度（200，400，800mg?L-1）的pH5.0丹酚酸B缓冲液中丹酚酸B大鼠鼻腔吸收特性。结果表明，鼻腔刺激性：pH4.0pH5.0pH6.0，pH6.0丹酚酸B缓冲液24h内变化的RSD为3.1%，稳定性差。优选刺激性小，稳定性好的pH5.0丹酚酸B缓冲液，其大鼠鼻灌流试验显示，丹酚酸B的鼻腔吸收符合一级吸收模型，为被动扩散。pH5.0的丹酚酸B缓冲液对鼻腔刺激性小，稳定性良好，在大鼠鼻灌流试验中吸收良好，对丹酚酸B鼻用制剂的开发有一定的意义。 　　[关键词]丹酚酸B；pH；刺激性；稳定性；大鼠鼻腔吸收 　　丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB），又称丹参酚酸B、丹参酸B、丹酚酸乙，是传统活血化瘀中药丹参的水溶性物质中活性最强的酚酸类化合物。丹酚酸B为3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，含量丰富，占丹参干重的2%～8%，约占总酚酸质量的60%。研究表明丹酚酸B有明确的抗脑缺血损伤作用，其作用与抗氧化、清除自由基、神经保护及血脑屏障保护等密切相关。药物经鼻腔给药，由鼻黏膜直接吸收入血，起效迅速，避免血脑屏障阻碍，具有显著的脑靶向性，对于脑中风患者鼻腔给药途径更具优势。因此为了开发丹酚酸B鼻腔给药制剂，本实验采用改良的大鼠在体鼻灌流模型考察丹酚酸B鼻腔吸收情况。 　　1 材料 　　Sartorius BT 125D电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Techcomp CT15RT高速离心机（上海天美科学仪器厂）；DB-300电子蠕动泵（上海之信仪器有限公司）；FE20实验室oH计（上海梅特勒―托利多仪器有限公司）；LC-20A岛津高效液相色谱仪（四元泵，紫外检测器）。 　　丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号11562-201313，以97.0%计）；丹酚酸B提取物（上海源叶生物科技有限公司，批号115939-25-8，以95.0%计）；非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团）；其他试剂均为分析纯。 　　SD大鼠，雄性，体重（250±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。 　　2 方法与结果 　　2.1 丹酚酸B含量测定 　　2.1.1 色谱条件DiamonsilTM钻石C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相甲醇-乙腈-甲酸-水（30：7：1：62），检测波长286nm，流速1.0mL?min-1，进样量10μL，柱温30℃，丹酚酸B出峰时间14.20min，该条件下，系统适应性良好，见图1。 　　2.1.2 线性关系考察 精密称取丹酚酸B对照品20.60mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并配制成对照品储备液。精密量取一定量的对照品储备液，用甲醇分别稀释为49.96，199.82，399.64，799.28，1498.65mg?L-1对照品溶液。在选定的色谱条件下，测定丹酚酸B的峰面积，以峰面积（4）对质量浓度（C）进行回归，标准曲线方程为A：13251C+15375，r=0.9995，丹酚酸B在49.96～1498.65mg?L-1与峰面积线性关系良好。 　　2.1.3 精密度考察 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，峰面积的RSD为0.076%，表明仪器的精密度良好。 　　2.1.4 稳定性考察 以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度（200，400，800mg?L-1）的丹酚酸B溶液，在4℃下放置不同时间（0，3，6，12，24h）后，15000r?min-1离心15min，吸取上清液进样，测定丹酚酸B的峰面积，其24h内RSD为1.0%，0.71%，0.72%，表明鼻灌流液中丹酚酸B在4℃下24h内稳定。 　　2.1.5 回收率考察 精密称取丹酚酸B对照品，以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度的丹酚酸B溶液，15000r?min-1离心15min，吸取上清液进样测定，计算测得含量，与理论值进行比较计算回收率，结果显示回收率在95.0%～105%，说明该方法准